Replicación biomimética de la microestructura de superficie raíz mediante alteración de la litografía blanda
5 de agosto de 2020
La biomimética se ha utilizado anteriormente como una herramienta para estudiar las interacciones hoja-microorganismo. Sin embargo, no existe tal herramienta para las raíces. Aquí, desarrollamos un protocolo para formar superficies sintéticas imitando la microestructura de la superficie de la raíz para el estudio de las interacciones entre la raíz y el entorno.
Este protocolo permite desarrollar un sistema sintético que imita la microestructura de la superficie de la raíz. El sistema se puede utilizar para estudiar las interacciones root-entorno de una manera de control con énfasis en la estructura de la superficie. Esta es una técnica simple que se puede realizar en cualquier laboratorio que estudia las interacciones root-environment.
Además, esta técnica permite la formación de la superficie a partir de diversos materiales. El paso más difícil es la eliminación de la raíz natural del molde negativo. Este paso requiere un manejo suave de la raíz para evitar rasgar los vellos de la raíz.
La demostración visual mejorará la capacidad del espectador para replicar este procedimiento. Comience por retirar la planta del suelo después de tres semanas de crecimiento. Cortar el sistema radicular de la planta en el punto de interacción con el tallo y poner la planta sin raíces en un vaso de precipitados con agua.
Después de unos días, corta las raíces adventicias que emergen del tallo y ústalas para la replicación. Para preparar las raíces germinadas de las semillas, moje un papel de filtro dentro de un plato de Petri con agua y coloque varias semillas M82 en el papel. Incubar el plato a 25 grados centígrados e hidratar el papel todos los días.
Aproximadamente cinco días después, las raíces germinantes serán lo suficientemente largas como para usarlas para la replicación. Preparar la solución de réplica negativa añadiendo 9,49 gramos de dimetralato de diuretano a una taza de 50 mililitros. Añadir 1,45 mililitros de metacrilato etílico a la taza y conservar a temperatura ambiente hasta que la solución se vuelva homogénea y se vea clara.
Añadir tres mililitros del plastificante y agitar la solución durante otra hora. A continuación, agregue 300 microlitros del iniciador de la foto y revuelva durante la noche o hasta que se eliminen todas las burbujas. Para generar la réplica negativa de la raíz, tome un portaobjetos de vidrio limpio y vierta un mililitro de la solución de réplica negativa en él.
Coloque de dos a tres raíces sobre la solución, asegurándose de que las raíces no estén completamente cubiertas. Mantenga la corredera debajo de una lámpara ultravioleta de ocho vatios durante ocho a 10 minutos y, a continuación, apague la lámpara UV. Retire la réplica del portaobjetos de vidrio y colóquela en un plato de Petri lleno de etanol para eliminar el monómero no reaccionado.
Utilice fórceps para eliminar lentamente y suavemente la raíz de la réplica. Para preparar la solución PDMS para la réplica positiva, coloque 10 gramos de dimetil siloxano en una taza. Agregue un gramo de agente de curado y mezcle bien.
Calentar la mezcla en un desecador al vacío durante dos horas para eliminar las burbujas de aire. Coloque la réplica negativa de poliuretano en un plato de Petri y vierta la mezcla PDMS encima de la réplica negativa. Aplicar vacío durante dos horas para asegurar la cobertura de la microestructura y mantener el plato Petri a temperatura ambiente durante la noche.
Al día siguiente, separe la réplica positiva curada de la réplica negativa mediante fórceps. Para preparar la réplica positiva de celulosa etílica, agregue 20 mililitros de etanol a una taza de 100 mililitros. A continuación, añadir 1,32 mililitros de plastificante y 3,3 gramos de celulosa etílica.
Y revuelva la solución a temperatura ambiente durante dos horas. Al día siguiente, vierta la solución de celulosa etílica encima de la réplica negativa en un plato de Petri y deje el plato debajo de la capucha durante la noche. A continuación, quite lentamente la réplica positiva de la réplica negativa con fórceps.
Se puede generar una buena réplica negativa si el protocolo se sigue correctamente. Esta réplica mostrará la estructura celular de la superficie de la raíz, así como los agujeros que representan la ubicación de los pelos de la raíz. Si la raíz está sumergida en la solución de poliuretano, quedará atrapada en el polímero duro y permanecerá dentro de la réplica negativa después de que se cure.
Al curar con la luz UV, superando el tiempo de curado recomendado, resultará en un molde de poliuretano extremadamente duro, por lo que es imposible eliminar la raíz sin romperla. A veces las piezas de raíz son tan pequeñas que se requiere microscopía para verlas. Se generaron réplicas positivas con PDMS y celulosa etílica.
Los pelos de raíz están en la zona de alargamiento donde comienzan a emerger. Sus longitudes varían a lo largo de la superficie de la raíz a medida que se hacen más largas, similares a la raíz natural. Algunos de los pelos de la réplica de celulosa etílica son incluso visibles bajo el microscopio de luz.
Al colocar la raíz sobre la solución de réplica negativa, es importante elegir el lado derecho y evitar la inmersión de la raíz dentro de la solución. Esta técnica fue desarrollada para proporcionar una nueva vía para investigar las interacciones del entorno de la superficie radicular. Específicamente, las fuerzas físicas causadas por la microestructura y las propiedades materiales de la superficie.
Descripción general
Este protocolo permite el desarrollo de superficies sintéticas que imitan la microestructura de la superficie radicular, facilitando estudios controlados de las interacciones entre la raíz y el entorno. La técnica es sencilla y puede realizarse en cualquier laboratorio dedicado al estudio de raíces.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biomimética
- Biología vegetal
- Micromorfología radicular
Antecedentes
- Estudios previos han utilizado biomiméticos para investigar las interacciones hoja-microorganismo.
- No existían herramientas disponibles para estudiar las interacciones radiculares.
- Este estudio aborda la brecha mediante la creación de superficies radiculares sintéticas.
- El protocolo enfatiza la importancia de la estructura de la superficie en los estudios sobre raíces y su entorno.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un sistema sintético que imite la microestructura de la superficie de la raíz.
- Permitir estudios controlados de las interacciones entre la raíz y el entorno.
- Proporcionar una técnica reproducible para investigadores en biología vegetal.
Métodos Utilizados
- Extracción de raíces de plantas y preparación de moldes negativos.
- Uso de dimetacrilato de diuretano y metacrilato de etilo para la creación de réplicas negativas.
- Preparación de réplicas positivas utilizando PDMS y etilcelulosa.
- Demuestras visuales para facilitar la replicación del procedimiento.
Resultados principales
- Generación exitosa de réplicas negativas y positivas de las superficies radiculares.
- Las réplicas representan con precisión la estructura celular y la ubicación de los pelos radiculares.
- Se demostró la viabilidad de utilizar diversos materiales para la replicación de superficies.
- Proporcionó información sobre las fuerzas físicas que afectan las interacciones entre la raíz y el entorno.
Conclusiones
- Esta técnica abre nuevas vías de investigación en las interacciones de la superficie radicular.
- Permite estudios detallados de los efectos de la microestructura sobre el comportamiento de las raíces.
- Las investigaciones futuras pueden basarse en este protocolo para explorar diversos factores ambientales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma biomimética permite la investigación controlada de los efectos de la microestructura de la superficie radicular en las interacciones microbianas, abordando una brecha crítica en la investigación sobre plantas y microorganismos. Al replicar arquitecturas delicadas de pelos radiculares en materiales sintéticos, el método posibilita la desactivación mecanicista de hipótesis relacionadas con procesos biológicos mediados por superficies. El enfoque proporciona un sistema escalable y reutilizable para evaluar cómo las características físicas de la superficie influyen en la colonización microbiana y en la secreción de enzimas dentro de flujos de trabajo de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las relaciones entre estructura y función en las interacciones raíz-microbio al aislar la topografía superficial como una variable independiente.
- Valor operativo: Proporciona superficies sintéticas reproducibles para realizar pruebas de hipótesis consistentes entre réplicas experimentales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera plantillas microestructurales cuantificables para la evaluación estandarizada de la adhesión microbiana y la actividad enzimática.
- Valor operativo: Permite la versatilidad de materiales (PDMS, etilcelulosa) para ajustar las propiedades de la superficie según objetivos específicos de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Facilita el seguimiento de la localización de microorganismos en relación con características superficiales definidas, permitiendo la correlación entre microestructura y resultados funcionales como la secreción de celulasa.
- Valor operativo: Ofrece una opción de etilcelulosa con capacidad de degradación para modelar cambios superficiales dinámicos en estudios preclínicos de desafío microbiano.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se sitúa en la etapa de biología del descubrimiento, permitiendo la generación de hipótesis sobre comportamientos microbianos mediados por superficies antes de las actividades de cribado de compuestos o de optimización de compuestos activos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la variación sistemática de la densidad de pelos radicales y de las características de la zona de alargamiento para evaluar su influencia en el comportamiento microbiano.
- Selección: Genera superficies estandarizadas y reproducibles para la evaluación de alta fidelidad de las interacciones microbianas bajo condiciones superficiales controladas.
- Análisis: Permite la cartografía espacial de la ubicación de microorganismos en relación con la microestructura superficial, proporcionando lecturas cuantitativas basadas en imágenes para estudios de interacción.
- Investigación Traductiva: Conecta el análisis de microestructuras en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante superficies biomiméticas que reflejan la arquitectura natural de las raíces.
- Reutilización Empresarial: Establece una tecnología de plataforma aplicable a múltiples especies vegetales y sistemas microbianos, reduciendo el desarrollo redundante de modelos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de raíz-microbio al desacoplar la estructura superficial de las variables químicas y biológicas.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de moldeado y replicación compatibles con equipos de laboratorio convencionales.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar modelos predictivos de superficies que reducen la dependencia de muestras naturales variables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de microorganismos diana o compuestos basada en perfiles de interacción dependientes de la estructura.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos vegetales y técnicas de litografía suave para la generación exitosa del molde.
- Necesita equipo de curado por UV y desecador al vacío para la producción de réplicas libres de burbujas.
- Exige protocolos estandarizados de preparación de raíces para garantizar una captura consistente de la microestructura entre lotes.
- Implica compromisos en la selección de materiales entre la durabilidad del PDMS y la biodegradabilidad del etilcelulosa, según los objetivos del estudio.
- Limitado por la necesidad de extraer las raíces con cuidado para preservar las estructuras delicadas de los pelos radicales durante la creación del molde negativo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
