Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos
12 de enero de 2021
Este protocolo describe cómo realizar experimentos optogenéticos para controlar la expresión génica con luz roja y roja lejana utilizando PhyB y PIF3. Se incluyen instrucciones paso a paso para construir un sistema de iluminación simple y flexible, que permite el control de la expresión génica u otra optogenética con una computadora.
El sistema permite a los investigadores construir fácilmente un sistema de iluminación económico y versátil para experimentos optogenéticos. Las ventajas de esta técnica incluyen la capacidad de programar el tiempo de iluminación LED con longitudes de onda disponibles que abarcan el espectro visible cercano al IR, y que los LED se pueden usar en una variedad de contextos. Para construir un circuito eléctrico, sujete la placa de circuito impreso en las manos de ayuda e inserte los cables de puente, conectándolos para formar los agujeros A1 y A3 al suelo, el cable de puente D2 en el agujero de alfiler D6, y la fuente de alimentación más los cables de puente número siete en el agujero de alfiler A7. Dobla los terminales 45 grados y añade flujo.
Después de soldar, recorte la parte posterior de los cables. Inserte un extremo del conector hembra de cable a cable soldado en el orificio A5. Luego conecte un extremo de la resistencia al orificio A5.
Conecte el otro extremo del conector a tierra. Luego conecte el otro extremo de la resistencia a tierra y suelde la conexión. Para el conector Arduino, engarce los extremos de los conectores de cable a cable y empuje los extremos engarzados a través del conector rectangular.
Para configurar los LED, coloque un cable calentando desde abajo mientras agrega soldadura desde la parte superior. Coloque una cantidad generosa de soldadura sobre la punta de soldadura grande y use la punta para calentar la base del LED en el flujo que contiene el contacto. Después de unos segundos, arrastre individualmente la soldadura a través de cada contacto y fije el cable negro en el cátodo con una pinza para el cabello.
Coloque una cantidad generosa de soldadura en la punta de soldadura grande y presione la punta sobre el cable hasta que la soldadura en la base del LED se derrita. Mantenga presionado el cable y retire el soldador mientras mantiene el cable en su lugar. Coloque una pequeña cantidad de pasta de soldadura en las almohadillas para las conexiones LED y use pinzas para colocar el LED sobre las almohadillas.
Sostenga el cable rojo preestañado en el ánodo y use una pinza para el cabello para sujetar el cable. Agregue la soldadura a la punta grande como se demostró y presione la punta sobre la conexión hasta que la soldadura en la base del LED se derrita y la pasta de soldadura se derrita y se convierta en plata. Para hacer los cables LED, coloque un tubo retráctil de 4,76 milímetros sobre el cable cortado a la longitud y un tubo retráctil de 3,18 milímetros sobre el conector de cable a cable.
Pelar y añadir fundente a los extremos del cable. Use las manos amigas para sujetar el conector de cable a cable y gire el extremo del conector con un extremo de cable. Suelde los materiales juntos y conecta el otro cable a la configuración de la misma manera y suelda.
Luego sujete los cables LED a las manos amigas con cinta adhesiva debajo de la base del LED. A continuación, mezcle epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante y extienda el epoxi sobre la parte superior del LED soldado. Usando la broca de pala, perfore un orificio de 1,5 centímetros a través de la parte superior de la caja en la que se colocará el LED y use una herramienta giratoria de alta velocidad para hacer una muesca en un lado del orificio para hacer espacio para el cable LED.
Pegue una pieza de 25 a 30 milímetros de película de privacidad en la caja negra que cubre el orificio por el que se iluminará el LED y pegue el LED fuera de la caja negra en la parte superior del agujero. Para un sistema de control de cuatro LED, perfore cuatro agujeros de 0,83 centímetros separados por 3,81 centímetros en la tapa de la caja y utilice una herramienta giratoria de alta velocidad para cortar un orificio rectangular de 1,19 por 1,90 centímetros en la esquina superior izquierda. Usando una broca de pala, perfore un agujero de 1,5 centímetros en la parte posterior de la caja e inserte una arandela en el agujero.
Para los LED controlados por computadora, lije el área donde se pegará el microcontrolador en la caja, así como la parte inferior del soporte del microcontrolador. Encaje el microcontrolador en el soporte y luego coloque epoxi el soporte y la caja juntos antes de asegurar el soporte en la caja negra. Luego coloque cinta de doble cara en el clip y asegure el clip dentro de la caja.
En muestras transfectadas para expresar fitocromo B pero no ficocianina bilina, la permeabilidad aumenta a medida que aumenta la cantidad de ADN reportero. Además, cuando todo el interruptor del gen del fitocromo B, incluido el plásmido productor de ficocianina bilina del cromo de nuestro orcio, se ilumina con luz roja lejana, la expresión de luciferasa también aumenta con las cantidades crecientes de construcción del reportero dentro de la mezcla de transfección. Del mismo modo, cuando las células sensibles a la luz se iluminan con luz roja, la expresión de luciferasa también aumenta con el aumento de la cantidad de reporteros.
Al comparar los niveles de inducción de las células tratadas con luz roja con las células tratadas con luz roja lejana, se encuentra una pequeña disminución en la activación del pliegue con cantidades crecientes de reportero. Es esencial seguir cuidadosamente cada paso al construir el circuito eléctrico y verificar los números de estenopeicos línea por línea antes de soldar cada componente. Este protocolo se puede utilizar para la estimulación óptica de muchos tipos de muestras o herramientas optogenéticas utilizando una variedad de longitudes de onda y permite la programación de horarios de iluminación.
Descripción general
Este protocolo describe la construcción de un sistema de iluminación versátil para experimentos de optogenética, que permite el control de la expresión génica mediante luz roja y luz roja lejana. Se proporcionan instrucciones paso a paso para armar el sistema y programar la iluminación con LED.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Optogenética
- Control de la expresión génica
- Sistemas de iluminación
Antecedentes
- La optogenética permite el control preciso de funciones celulares mediante la luz.
- PhyB y PIF3 son componentes clave en la regulación génica sensible a la luz.
- Los LED pueden programarse para diversos horarios de iluminación.
- Este sistema está diseñado para ser rentable y adaptable a diferentes configuraciones experimentales.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la construcción de un sistema de iluminación optogenético.
- Permitir a los investigadores controlar la expresión génica utilizando longitudes de onda específicas de luz.
- Facilitar el uso de herramientas optogenéticas en diversos contextos experimentales.
Métodos Utilizados
- Construcción de un circuito eléctrico para el control de LED.
- Programación del tiempo de iluminación y longitudes de onda del LED.
- Ensamblaje de un microcontrolador para control automatizado.
- Prueba del sistema con diversas construcciones reporteras.
Resultados principales
- Construcción exitosa de un sistema de iluminación flexible.
- Aumento de la expresión de luciferasa observado con mayores cantidades de ADN reportero.
- Control demostrado sobre la expresión génica utilizando luz roja y roja lejana.
- El sistema permite la estimulación óptica en diferentes tipos de muestras.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para experimentación optogenética.
- Los investigadores pueden utilizar este sistema para diversas aplicaciones en la regulación génica.
- El estricto cumplimiento del protocolo asegura resultados exitosos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El control optogenético de las vías celulares permite una interrogación mecanicista precisa en la validación de dianas y en los cribados fenotípicos. Un sistema de iluminación programable y de bajo costo permite la administración reproducible de luz para estudios de expresión génica, reduciendo la variabilidad técnica en modelos preclínicos. Este enfoque mejora la confianza predictiva al permitir una estimulación óptica estandarizada en diversos contextos experimentales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite probar hipótesis sobre interruptores génicos sensibles a la luz para aclarar la función de vías y el mecanismo del blanco.
- Valor operativo: Proporciona intensidad y temporización ajustables del LED para perturbar de manera controlada las vías de señalización en ensayos celulares.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Apoya la preparación de sistemas biológicos estandarizados para cuantificar respuestas optogenéticas frente a perturbaciones químicas o genéticas.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante programación de horarios de iluminación y selección de longitudes de onda para obtener lecturas reproducibles.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la estimulación óptica de sistemas relevantes para la enfermedad con parámetros de luz ajustables.
- Valor operativo: Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de respuestas dependientes de la dosis a luz roja y roja lejana en ensayos basados en reporteros.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El sistema de iluminación se integra en los flujos de trabajo de biología del descubrimiento al permitir la perturbación óptica controlada de la expresión génica, apoyando la identificación de compuestos activos mediante resultados fenotípicos cuantificables.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la desactivación de mecanismos mediante el control preciso en el tiempo y el espacio de herramientas optogenéticas para investigar la función del objetivo.
- Selección: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes, como la expresión de luciferasa bajo condiciones definidas de iluminación.
- Análisis: Genera datos reproducibles de respuesta a dosis de luz que orientan el análisis estadístico para la validación de objetivos y la confirmación de resultados positivos.
- Investigación Traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar una plataforma reutilizable para probar constructos optogenéticos en modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Diseñada como una capacidad escalable y adaptable para múltiples proyectos que requieren control óptico de procesos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en experimentos controlados por luz.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad de protocolos de iluminación entre laboratorios y configuraciones experimentales.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción mediante lecturas optogenéticas fiables y cuantificables que reducen los falsos positivos en la validación de objetivos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en resultados reproducibles de estimulación óptica.
Consideraciones de Implementación
- Competencia básica en electrónica para el montaje de circuitos y la soldadura de conexiones LED.
- Acceso a microcontroladores compatibles con Arduino e instrumentos de soldadura para la construcción del sistema.
- Normalización de protocolos de iluminación entre equipos para garantizar condiciones experimentales reproducibles.
- Consideraciones de adaptación para diferentes herramientas optogenéticas que requieren longitudes de onda específicas o rangos de intensidad.
- Limitación práctica: puede ser necesaria una calibración manual para optimizar la posición del LED y la penetración de la luz según el tipo de muestra.
