Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente
28 de marzo de 2021
Las células madre del glioma (GSC) son una pequeña fracción de las células cancerosas que desempeñan un papel esencial en la iniciación del tumor, la angiogénesis y la resistencia a los medicamentos en el glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más prevalente y devastador. La presencia de GSC hace que el GBM sea muy refractario a la mayoría de los agentes dirigidos individuales, por lo que se requieren métodos de detección de alto rendimiento para identificar posibles terapias combinadas efectivas. El protocolo de
Las células madre del glioma son una subpoblación de células en el glioma, que generalmente son resistentes a la quimioterapia y la radioterapia. Aquí describimos el método para la identificación rápida de terapias combinadas, dirigidas a células madre de glioma, en lugar de células de glioma diferenciadas. En comparación con otros métodos, que pueden ser laboriosos y complicados.
Este protocolo es relativamente simple y rápido, para identificar posibles combinaciones de medicamentos útiles. Comience recolectando las células madre del glioma o GSC del medio de cultivo y centrifugándolas a 70 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, digiera las células con accutase durante cuatro minutos a 37 grados centígrados.
Usando una punta de 200 microlitros, pipetee las células repetidamente para disociarse y vuelva a enviar la bolita celular. Agregue las GSC a una densidad de 200, 000 células en un mililitro de medio de cultivo, en cada pozo de una placa de cultivo de 12 pozos, e incube durante la noche. Oh, al día siguiente, agregue 30 microlitros de sobrenadante del virus luciferasa-eGFP en cada pozo de la placa.
Centrifugar las células a 1000 veces G durante dos horas, a 25 grados centígrados e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio en los pozos recolectando los GSC, centrifugando, retirando el sobrenadante, reutilizándolos en medio fresco y replatándolos. Culta las células durante otras 48 horas.
Observe la placa bajo un microscopio fluorescente y confirme la aparición de células GFP positivas. Clasonde y recoge las GSC con una alta fluorescencia utilizando un clasificador de células de flujo y cultivalas aún más. Cubra 96 placas inferiores ópticas de pozo con una mezcla de matriz extracelular, como matrigel, e incube durante una hora a 37 grados centígrados.
Retire el exceso de mezcla y enjuague suavemente las placas una vez con PBS, luego sellen las células XG387-Luc a una densidad de 1000 células en 100 microlitros de medio de cultivo, y a cada pozo de las placas recubiertas y cultivarlas durante la noche. Al día siguiente, observe las células bajo un microscopio para confirmar su unión a la placa. A continuación, prepare una solución de temozolomida micromolar de 200 y dos soluciones micromolares de los agentes objetivo, en medio de cultivo.
Para la detección combinada de fármacos, retire el medio en blanco y agregue el medio que contiene 200 temozolomida micromolar o dos agentes dirigidos micromolares, o una combinación de ambos, en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres días. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS.
Utilizando el software incorporado, cree múltiples áreas circulares de la región de interés y cuantifique la bioluminiscencia celular. Para identificar posibles candidatos que podrían mejorar el efecto antiglioblastoma de la temozolomida, se analizaron 20 inhibidores selectivos de moléculas pequeñas objetivo a través de la detección de combinaciones de fármacos. Los valores del índice sensible de 13 agentes objetivo estaban por encima de cero y cinco de ellos estaban por encima de 0,1.
El índice sensible de los dos principales fármacos candidatos UMI-77 y A 83-01, fue superior a 0,25, lo que sugiere su potencial para sinergizar con temozolomida. El tratamiento combinado de temozolomida y UMI-77 se evaluó mediante un ensayo antiproliferativo en una matriz de titulación de dosis de seis por seis. Los valores del índice de combinación fueron inferiores a uno.
Y los altos valores de un solo agente fueron mayores que cero para la mayoría de las combinaciones de temozolomida y UMI-77 en diferentes concentraciones. Sugiriendo una interacción sinérgica general de temozolomida y UMI-77 en las GSC XG387 y XG328. Este protocolo también se puede aplicar para encontrar una combinación de medicamentos utilizando células cancerosas adherentes simplemente eliminando el paso de recubrimiento de la placa.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo optimizado para la identificación rápida de combinaciones de fármacos sinérgicos dirigidas a las células madre del glioma (GSC) en glioblastoma (GBM). El flujo de trabajo utiliza GSC marcadas con luciferasa, placas recubiertas con matrigel y un cribado de alto rendimiento basado en bioluminiscencia para evaluar la eficacia de terapias combinadas, con el objetivo de superar la resistencia de las GSC a los tratamientos convencionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del cáncer
- Investigación con células madre
- Descubrimiento de fármacos
- Neuro-oncología
Antecedentes
- Las células madre de glioma son una subpoblación dentro de los tumores de glioblastoma, que contribuyen a la iniciación tumoral, la angiogénesis y la resistencia a la terapia.
- Las CMC son altamente refractarias a las terapias dirigidas con un solo agente, lo que requiere el desarrollo de tratamientos combinados.
- Los métodos tradicionales de cribado de fármacos en CMC suelen ser laboriosos y complejos.
- Se necesitan protocolos de cribado rápidos y eficientes para identificar combinaciones de fármacos efectivas contra las CMC.
Objetivo del estudio
- Establecer un flujo de trabajo sencillo y rápido para la selección de combinaciones de fármacos potencialmente sinérgicas dirigidas a las CSG.
- Validar la capacidad del protocolo para identificar combinaciones que potencien el efecto anti-glioblastoma de las terapias estándar.
- Mostrar la aplicabilidad del protocolo tanto a CSG como a células cancerosas adherentes.
Métodos Utilizados
- Aislamiento y cultivo de células madre de glioma a partir de líneas celulares establecidas.
- Transducción de CMC con virus luciferasa-eGFP para imágenes de bioluminiscencia.
- Clasificación de CMC positivas para GFP mediante citometría de flujo.
- Siembra de CMC en placas de 96 pocillos recubiertas con matrigel para cribado de fármacos.
- Tratamiento con temozolomida, agentes dirigidos o sus combinaciones en réplicas técnicas.
- Cuantificación de la bioluminiscencia celular mediante el sistema de imagen IVIS Spectrum y análisis de la sinergia farmacológica mediante los valores del índice de sensibilidad y del índice de combinación.
Resultados principales
- Se analizaron veinte inhibidores pequeños de moléculas dirigidas en combinación con temozolomida.
- Trece agentes mostraron valores positivos del índice de sensibilidad, cinco de ellos superando 0,1.
- UMI-77 y A 83-01 mostraron la mayor sinergia con temozolomida (índice de sensibilidad > 0,25).
- Los valores del índice de combinación para temozolomida y UMI-77 fueron menores a uno, lo que indica efectos anti-proliferativos sinérgicos en múltiples líneas de CSG.
Conclusiones
- El protocolo descrito permite la identificación rápida y eficiente de combinaciones de fármacos sinérgicas dirigidas a las CSG.
- UMI-77 y A 83-01 son candidatos prometedores para terapia combinada con temozolomida en GBM.
- Este flujo de trabajo puede adaptarse para su uso con células cancerosas adherentes omitiendo el paso de recubrimiento de la placa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación rápida de combinaciones de fármacos sinérgicos dirigidas a células madre del glioma (GSC) aborda un cuello de botella crítico en el desarrollo de terapias para glioblastoma (GBM). Este flujo de trabajo permite un cribado cuantitativo de alto rendimiento para reducir los riesgos asociados a estrategias de combinación frente a células iniciadoras de tumores altamente resistentes. La integración temprana de este tipo de cribado en la fase de desarrollo refuerza la confianza predictiva y la selección de carteras para GBM y otros cánceres refractarios.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar hipótesis terapéuticas centradas en mecanismos de resistencia impulsados por CSG.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la prueba directa de sinergia farmacológica en poblaciones de células madre relevantes para la enfermedad.
- Facilita la validación funcional de dianas a través de mediciones cuantitativas de viabilidad y proliferación.
- Mejora la confianza predictiva para avanzar regímenes de combinación en carteras de tratamiento para GBM.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara sistemas GSC validados con etiqueta de luciferasa para flujos de trabajo de cribado robustos en etapas posteriores.
- Normaliza las condiciones del ensayo utilizando placas recubiertas con matrigel y réplicas técnicas para garantizar la reproducibilidad.
- Genera resultados cuantitativos de bioluminiscencia para la evaluación y comparación fiable de compuestos.
- Permite el cribado escalable y de alto rendimiento de múltiples combinaciones de fármacos en paralelo.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Alinea los resultados del cribado con la biología de las CSG relevantes para la enfermedad, garantizando una continuidad traslacional.
- Facilita el avance ajustado al riesgo de terapias combinadas hacia modelos preclínicos de GMB.
- Proporciona una reducción del riesgo mecanicista al confirmar la sinergia en múltiples líneas de CSG derivadas de pacientes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo de cribado conecta el descubrimiento inicial con la identificación de fármacos líderes al permitir una evaluación rápida y cuantitativa de la sinergia farmacológica en células madre glioblásticas derivadas de pacientes. Los resultados orientan la priorización preclínica y las estrategias de biomarcadores traslacionales para terapias combinadas en glioblastoma.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la resistencia impulsada por CSG.
- Tamizaje: Proporciona datos cuantitativos reproductibles de bioluminiscencia para la selección de compuestos.
- Análisis: Ofrece valores sensibles de índice e índice de combinación para comparar la sinergia en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante el uso de CSG derivadas de pacientes y protocolos adaptables para células cancerosas adherentes.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y escalable para el tamizaje de combinaciones en portafolios de oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el desarrollo de terapias combinadas.
- Valor operativo: Agiliza el cribado mediante flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Permite tomar mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo y una mayor eficiencia del capital al enfocarse desde el inicio en combinaciones sinérgicas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de terapias prometedoras para el GBM.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de CSC, transducción viral y citometría de flujo para clasificación celular.
- Necesita acceso a sistemas de imagen bioluminiscente y software analítico para lecturas cuantitativas.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de configuración del ensayo y análisis de datos.
- Adaptable a otros modelos de cáncer mediante la modificación de los pasos de recubrimiento de placas y preparación celular.
- Depende de la disponibilidad de líneas de CSC derivadas de pacientes y bibliotecas de compuestos validados.
