Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120
19 de agosto de 2021
La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.
Este protocolo es significativo porque es un método optogenético, o activado por la luz, para inducir la expresión génica, en un organismo intacto. En nuestro caso, un embrión de pez cebra. La ventaja de esta técnica, es que utiliza la luz, como agente inductor, lo que permite un control muy preciso, espacial y temporal de la inducción.
Este protocolo sería útil para cualquier situación en la que la expresión génica inducible sería útil. Esto incluye cosas como el rastreo de linaje, ensayos de ganancia de función o experimentos de rescate. Para empezar, coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones para entregar 1,5 milivatios por centímetro cuadrado de potencia de luz a varios embriones a la vez.
Para reducir el riesgo de daño fotográfico al activador transcripcional de la cola, coloque la luz a intervalos de una hora de encendido y apagado utilizando un relé de temporizador, si se ilumina durante más de tres horas. Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación. Coloque placas de Petri que contengan embriones de control y una caja a prueba de luz para controles oscuros.
Retire los embriones de la iluminación, después de la duración de activación deseada. Para la extracción total de ARN, utilice un kit de extracción de ARN. Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y elimine el exceso de agua de huevo.
Después de agregar el tampón de lisis, homogeneice los embriones con el mortero de plástico. Transfiera el lisato a una columna provista del kit y siga las instrucciones del fabricante para purificar el ARN. Almacene el ARN purificado, a menos 20 a menos 80 grados Celsius, hasta que use o sintetice inmediatamente el ADNc a partir de un microgramo, ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Agregue un microgramo de ARN en una pared delgada de 0,2 mililitros, tubo de PCR, que contiene cuatro microlitros, de cinco veces la mezcla maestra de reacción de ADNc, seguido de la adición de un microlitro, de 20 veces la solución enzimática de transcriptasa inversa. A continuación, conscierre un volumen final de 20 microlitros, con agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en un termociclador programado para la síntesis de ADNc.
Almacene el ADNc sintetizado a menos 20 grados centígrados hasta su uso o úselo inmediatamente para la evaluación cuantitativa. Configure las reacciones cuantitativas de PCR que contienen una mezcla maestra de enzimas verdes cibernéticas. Cinco cebadores diluidos de ADNc y GFP a una concentración nanomolar de 325 en triplicados y conducen la reacción en una máquina de PCR programada en tiempo real.
Al finalizar la reacción, analice la curva de fusión para determinar la especificidad de la reacción. Calcule la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones de control utilizando el método de TC Delta doble. Y use software estadístico para determinar la significación.
Después de retirar los embriones de la iluminación, inmovilice los embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio. Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un microscopio estéreo fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.
La cuantificación de la expresión de GFP indicó la inducción de la expresión tan pronto como 30 minutos después de la exposición a la luz azul. Los niveles de expresión de GFP continuaron aumentando hasta seis horas, después de la activación de manera constante. La inducción de GFP también se evaluó cualitativamente examinando la intensidad de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo posteriores a la activación.
La fluorescencia GFP por encima de los niveles de fondo se observó por primera vez a las tres horas posteriores a la activación y se volvió notablemente más brillante a las seis horas después de la activación. En contraste, los embriones de control para todos los puntos de tiempo, mantenidos en la oscuridad, no exhibieron ninguna fluorescencia GFP apreciable. La luz activadora debe estar en el rango azul del espectro de luz visible.
Tanto la luz de la habitación como la luz solar contienen algo de luz azul. Así que tenga cuidado de proteger sus controles negativos de cualquier fuente de luz ambiental. El sistema TAEL C120, está codificado genéticamente y es modular y puede impulsar la expresión de cualquier gen de interés.
Por lo tanto, combinado con otras técnicas, se puede utilizar para responder a una variedad de preguntas biológicas.
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Descripción general
Este protocolo demuestra el uso de la optogenética para lograr la expresión génica inducible por luz en embriones de pez cebra. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul permite un control preciso sobre la expresión génica en un organismo intacto.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Optogenética
- Expresión génica
- Modelos de pez cebra
Antecedentes
- La optogenética es un método activado por luz para inducir la expresión génica.
- Esta técnica proporciona control espacial y temporal de la inducción.
- Es particularmente útil para el rastreo de linajes y ensayos de ganancia de función.
- Los embriones de pez cebra sirven como modelo para estudiar la expresión génica in vivo.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método para la expresión génica inducible por luz.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en aplicaciones optogenéticas.
- Facilitar experimentos que requieran un control preciso sobre la expresión génica.
Métodos Utilizados
- Colocar un panel LED en relación con placas de Petri que contienen embriones.
- Entregar 1,5 milivatios por centímetro cuadrado de luz.
- Inducir la expresión génica en múltiples embriones simultáneamente.
- Utilizar el sistema optogenético TAEL/C120 para el control génico.
Resultados Principales
- Inducción exitosa de la expresión génica en embriones de pez cebra.
- Se demostró el control espacial y temporal sobre la activación génica.
- Se proporcionó un protocolo confiable para futuros estudios optogenéticos.
- Se resaltaron las ventajas del uso de la luz como agente inductor.
Conclusiones
- La optogenética ofrece una herramienta potente para estudiar la función génica.
- El sistema TAEL/C120 es eficaz para inducir la expresión génica in vivo.
- Este método puede aplicarse a diversos escenarios de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El control optogenético de la expresión génica permite interrogar con precisión los blancos biológicos en espacio y tiempo en condiciones in vivo, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. El sistema TAEL/C120 proporciona una plataforma genéticamente codificada y activable por luz para validar hipótesis terapéuticas con lecturas cuantitativas. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en la validación de blancos al permitir una modulación reversible y dependiente de la dosis de la expresión génica en embriones de pez cebra.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la activación génica inducible y reversible en un modelo de vertebrado intacto.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas al vincular la expresión inducida por luz con lecturas fenotípicas mediante un reportero GFP y la cuantificación por qRT-PCR.
- Valor predictivo: Facilita experimentos de ganancia de función y de rescate para evaluar la suficiencia de la diana y la relevancia de la vía en contextos relacionados con enfermedades.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera expresión cuantitativa de GFP dependiente de la luz, medible mediante microscopía de fluorescencia y qRT-PCR, para la selección de compuestos o condiciones.
- Reproducibilidad: Permite protocolos de inducción estandarizados con intensidad de luz definida (1,5 mW/cm²) y control temporal para minimizar la variabilidad entre réplicas.
- Escalabilidad: Compatible con formatos de múltiples pocillos utilizando paneles de LED para tratar múltiples embriones simultáneamente bajo iluminación controlada.
Investigación Translacional y Preclínica
- Modelado de enfermedades: Apoya modelos preclínicos basados en pez cebra en los que el control temporal de la expresión génica imita intervenciones terapéuticas inducibles.
- Alineamiento de biomarcadores: Las señales de GFP y los resultados de qRT-PCR sirven como lecturas farmacodinámicas trasladables para la activación de vías y la modulación del blanco.
- Mitigación de riesgos: Permite reducir los riesgos asociados a blancos al evaluar su necesidad y suficiencia mediante diseños de ganancia de función inducible y de rescate antes de los estudios en mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, permitiendo la validación iterativa de dianas moleculares en un sistema vertebrado.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la suficiencia del blanco y la activación de vías mediante expresión inducida por luz y controlada temporalmente in vivo.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y normalizados (cambio relativo de GFP) para comparar condiciones genéticas o farmacológicas.
- Análisis: Utiliza qRT-PCR con método delta delta CT e intensidad de fluorescencia para comparaciones estadísticas entre controles inducidos y oscuros.
- Investigación Traducional: Relaciona la expresión inducible con resultados fenotípicos en pez cebra, facilitando la continuidad hacia pruebas de eficacia preclínicas.
- Reutilización Empresarial: El sistema modular TAEL/C120 puede activar cualquier gen de interés, posibilitando su reutilización en múltiples blancos y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar un control temporal preciso sobre la expresión génica en un organismo complejo.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la entrega estandarizada de luz y controles internos en oscuridad para compensar la variabilidad ambiental.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al permitir la modulación rápida y reversible de dianas para evaluar sus consecuencias fenotípicas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al validar dianas en un sistema fisiológicamente relevante e inducible antes del avance intensivo en recursos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, microinyección y configuración de hardware optogenético.
- Depende de sistemas de iluminación con LED capaces de proporcionar un control preciso de la intensidad y el tiempo de luz azul.
- Necesita protocolos estandarizados para la duración de la exposición a la luz y el mantenimiento de controles en oscuridad, a fin de garantizar la comparabilidad de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse en diferentes estadios embrionarios o fondos genéticos.
- Está limitado por la penetración de la luz en tejidos opacos, aunque esta limitación se mitiga en los embriones de pez cebra debido a su transparencia óptica.
