Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

La visualización de fagos no solo nos ayuda a investigar las características de unión de enzimas clínicamente importantes, sino que también desarrolla moduladores para esas enzimas y las enfermedades correspondientes. La pantalla de fagos se puede utilizar para desarrollar nuevos aglutinantes para una amplia gama de proteínas objetivo y también es más fácil de realizar que otros métodos de visualización convencionales. Este procedimiento implicó una gran cantidad de acciones repetitivas, por lo que la clave es no piloto automático y permanecer enfocado en todo momento.

Comience inoculando 30 mililitros de caldo de tetraciclina 2YT con 200 microlitros del cultivo de semillas. Incubarlo durante aproximadamente tres horas a 37 grados centígrados con agitación orbital de 200 RPM hasta que las bacterias estén en la fase de registro medio. Deseche la solución de recubrimiento de la placa en un fregadero.

Sécalo suavemente con toallas de papel. Luego agregue 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto. Deseche el tampón de PB del plato y séquelo en toallas de papel.

Agregue otros 200 microlitros de tampón de PB a cada pozo recubierto de la placa. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM. Descongele la biblioteca de fagos en hielo, luego diluya a 100 veces la diversidad de la biblioteca en PBS.

Agregue la solución de cloruro de sodio de polietilenglicol a una quinta parte del volumen de la biblioteca diluida e incube la solución en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugue la solución a 11, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y centrímelo durante otros dos minutos para tirar del sobrenadante restante y concentrar el gránulo de fago.

Resusped suavemente el pellet de fago en un mililitro de tampón PBT por proteína objetivo a analizar, típicamente cuatro en total. Agregue 100 microlitros de biblioteca de fagos a cada pozo recubierto en la placa de control. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.

Deseche el tampón de PB de la placa objetivo en el fregadero y séquelo en toallas de papel. Transfiera los 100 microlitros de la biblioteca de fagos en la placa de control a cada pozo recubierto de la placa objetivo. Incubarlo a temperatura ambiente durante una hora con agitación orbital de 300 RPM.

A continuación, retire la biblioteca de fagos de la placa y lave los pozos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y toque una toalla de papel para quitar las últimas gotas de tampón. Agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico molar 0.1 a cada pozo recubierto para eludir el fago.

Incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos con agitación orbital de 300 RPM. Después de eso, neutralice el pH agregando 12.5 microlitros de pH 11 un triclorhidrato molar a cada pozo recubierto. Transfiera el fago eluido de los ocho pocillos a un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para hacer soluciones homogéneas y aspirar todo el líquido de los pozos. Agregue 10% BSA al fago eluido para hacer la concentración final 1% Almacene el tubo de la microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Esta es la salida redonda.

Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección inoculando cinco mililitros de cultivo de semillas de tetraciclina 2YT con una colonia aislada de E. coli de una placa de agar. Incubarlo durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Diluya la proteína objetivo en las rondas dos y tres tubos con una cantidad adecuada de PBS.

Tome la mitad del contenido de las rondas dos y tres tubos y cubra cuatro pocillos por proteína objetivo en una placa de unión de 96 pocillos para la siguiente ronda. A continuación, use la mitad de la salida redonda para inocular tres mililitros de células de fase logarítmica media. Incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos con un temblor orbital de 200 RPM.

Agregue el fago auxiliar M13KO7 a una concentración final de 10 mil millones de PFU por mililitro. Incubarlo de nuevo a 37 grados centígrados durante una hora con un temblor orbital de 200 RPM. Después de una hora, transfiera los tres mililitros completos de cultivo a 30 mililitros de solución de kanamicina de carbenicilina 2YT.

Crece durante la noche a 37 grados centígrados con un temblor orbital de 200 RPM. Los resultados representativos para una selección de variantes de ubiquitina contra UBE4B se muestran aquí. Los UBV se ordenaron de mayor a menor frecuencia.

Las secuencias representan la región diversificada de ubiquitina en el UBV con todos los residuos aleatorios. La afinidad de unión relativa de los aglutinantes a la proteína diana de tipo salvaje, la proteína diana mutada, así como las proteínas fuera del objetivo se mide mediante ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas o ELISA. Todas las absorbancias de ELISA se normalizaron contra 96 puntajes promedio de BSA ELISA y 96 puntajes promedio de GST ELISA.

El verde más oscuro representa la unión relativa más fuerte. Gst se incluyó como un control para la unión inespecífica porque la proteína objetivo está marcada con GST. Los resultados de ELISA se presentan gráficamente aquí.

El eje x representa las UBV y el eje y representa la absorbancia normalizada correspondiente. Al intentar este procedimiento, es importante que no deseche la solución en la placa después de agregar el ácido clorhídrico. Los fagos ahora están suspendidos en solución y desea conservarlos para que pueda realizar análisis finales de enriquecimiento posteriores o ambos.

Después de este procedimiento, se debe realizar la secuenciación para determinar las frecuencias de UBV. Los ensayos ELISA e IC50 se pueden realizar para determinar las eficacias de unión y las eficacias inhibitorias, respectivamente, y también para ayudar a determinar qué UBV caracterizar más a fondo.