Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral
2 de junio de 2023
En este artículo, se describe un protocolo para la inmunofluorescencia múltiple (mIF) de amplificación manual de señal de tiramida (TSA) combinada con análisis de imágenes y análisis espacial. Este protocolo se puede utilizar con secciones fijadas en parafina con formalina (FFPE) para la tinción de dos a seis antígenos por portaobjetos, dependiendo del escáner de portaobjetos disponible en el laboratorio.
En nuestro laboratorio, estamos estudiando el cáncer colorrectal humano. Su progresión a enfermedad metastásica y su respuesta al tratamiento, incluida la inmunoterapia. Estamos tratando de encontrar nuevos biomarcadores predictivos y pronósticos mediante la investigación del microambiente inmune tumoral y el microbioma intratumoral en la enfermedad primaria y metastásica.
En nuestro proyecto actualmente estamos implementando varias tecnologías como la secuenciación de ARN, la secuenciación del exoma completo, la secuenciación TCR del análisis de ADN libre de células circulantes, la inmunofluorescencia y la hibridación del instituto de fluorescencia. En este momento, nuestro principal desafío es combinar la tinción de hibridación del instituto de fluorescencia con la inmunofluorescencia múltiple de amplificación de señal de tiramida para estudiar la interacción entre el microbioma y las células inmunes. Nuestro método es robusto, reproducible, fácil de usar y rentable.
Se puede configurar en cualquier laboratorio que posea un escáner de luz fluorescente y el método se puede usar con cualquier anticuerpo IHC disponible comercialmente en oposición a los kits disponibles comercialmente que generalmente están optimizados para un panel restringido de antígenos.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para la amplificación manual de la señal mediante tirosina (TSA) con inmunofluorescencia múltiple (mIF) combinada con análisis de imagen y análisis espacial. El método es aplicable a secciones fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) para la tinción de múltiples antígenos por portaobjetos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Patología
Antecedentes
- Investigación del cáncer colorrectal humano y su progresión.
- Enfoque en el microambiente inmunitario del tumor y el microbioma intratumoral.
- Uso de diversas tecnologías, incluyendo secuenciación de ARN e inmunofluorescencia.
- Dificultades para combinar diferentes métodos de tinción en análisis integrales.
Objetivo del estudio
- Para encontrar nuevos biomarcadores predictivos y pronósticos.
- Para estudiar la interacción entre el microbioma y las células inmunitarias.
- Para desarrollar un método de tinción robusto y reproducible.
Métodos Utilizados
- Inmunofluorescencia multiplexe con amplificación manual de señal por tirosina.
- Análisis de imágenes mediante algoritmos de fluorescencia de alto multiplexaje.
- Hibridación fluorescente in situ combinada con inmunofluorescencia.
- Protocolo detallado de tinción para secciones de tejido FFPE.
Resultados principales
- Tinción exitosa de múltiples antígenos en un solo portaobjetos.
- Optimización de la especificidad del anticuerpo y relación señal-ruido.
- Análisis de imagen eficaz que produce datos cuantificables.
- Demuestra la aplicabilidad del método en diversos laboratorios.
Conclusiones
- El método TSA mIF es versátil y rentable.
- Puede adaptarse a diversos anticuerpos y antígenos.
- Este enfoque mejora la comprensión de la biología tumoral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunofluorescencia múltiple (mIF) con análisis espacial de imágenes permite la obtención de mapas cuantitativos de alto contenido del microambiente tumoral (TME), apoyando el descubrimiento de biomarcadores y la reducción de riesgos mecanicistas en las líneas de investigación oncológica. Este flujo de trabajo proporciona información útil sobre las interacciones entre células inmunitarias y estromales, orientando estrategias de biomarcadores predictivos e investigaciones traslacionales. Su reproducibilidad y compatibilidad con diversos anticuerpos lo posicionan como una capacidad escalable para la investigación y desarrollo oncológicos a nivel empresarial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación con resolución espacial de las interacciones entre células inmunitarias y tumorales para la validación de objetivos terapéuticos.
- Apoya la reducción del riesgo mecanicista mediante la cuantificación de densidades y proximidades de tipos celulares dentro de los compartimentos tumorales.
- Facilita la identificación de nuevos biomarcadores predictivos y pronósticos para la selección de carteras.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de tejidos validados para el cribado multiplexado de biomarcadores en pasos posteriores.
- Proporciona datos espaciales estandarizados, reproducibles y cuantitativos para el desarrollo de ensayos.
- Permite una evaluación robusta de la especificidad de los anticuerpos y la optimización de la relación señal-ruido para la preparación al cribado.
Investigación Translacional y Preclínica
- Alinea el análisis espacial de biomarcadores con modelos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de características del microambiente tumoral (TME) con hipótesis sobre la respuesta terapéutica.
- Proporciona resultados cuantitativos para comparaciones entre estudios y cohortes en investigaciones preclínicas.
Integración de la Canalización y del Flujo de Trabajo
Este flujo de trabajo de mIF y análisis espacial conecta el descubrimiento temprano, la validación de biomarcadores y la investigación traslacional en carteras de oncología.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica las distribuciones de células inmunitarias y estromales para aclarar los mecanismos impulsados por el microambiente tumoral (TME).
- Cribado: Estandariza ensayos tisulares multiplexados para obtener lecturas cuantitativas y reproducibles.
- Análisis: Exporta datos espaciales y de densidad para la comparación estadística de compartimentos tumorales e interacciones celulares.
- Investigación Traducional: Relaciona los patrones espaciales de biomarcadores con la respuesta terapéutica, apoyando la continuidad de preclínica a clínica.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a cualquier panel de anticuerpos y tipo de tumor, lo que permite una amplia aplicación en carteras de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de biomarcadores y dianas al resolver las interacciones espaciales entre células.
- Valor operativo: Proporciona un análisis de tejidos multiplexado reproducible, escalable y rentable.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción de proyectos y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas mediante una caracterización robusta del microentorno tumoral (TME).
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos en oncología basada en evidencia espacial de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunofluorescencia, análisis de imágenes y procesamiento estadístico de datos.
- Necesita acceso a un escáner de portaobjetos fluorescentes y software de análisis de imágenes compatible.
- Exige la estandarización entre equipos de la validación de anticuerpos y los protocolos de tinción.
- Adaptable a diferentes tipos de tumores y paneles de anticuerpos con una optimización adecuada.
- Depende de la especificidad rigurosa de los anticuerpos y de la optimización de la relación señal-ruido para obtener resultados confiables.
