Preparación de muestras para criotomografía in situ de células de mamíferos
15 de diciembre de 2023
Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (EM) para criotomografía celular in situ y microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM).
El objetivo de esta investigación es desarrollar una metodología para la preparación de muestras que sea accesible y reproducible de forma fiable. Al lograr esto, el poder de la criotomografía celular directa se puede utilizar para responder a una amplia variedad de preguntas biológicas. Los desafíos de la preparación de la red son extensos.
Las celdas no se adhieren fácilmente a las cuadrículas, y la manipulación puede provocar daños en la capa de carbono, lo que resulta en la pérdida de áreas de cuadrícula que se pueden fotografiar. Además, la prevalencia de protuberancias celulares delgadas se reduce si no se presta atención a las condiciones adecuadas de preparación de la muestra. Los protocolos actuales suelen requerir equipos especializados para resolver los principales cuellos de botella de la siembra, como los micropatrones y los soportes impresos en 3D para la fijación y manipulación de las células, respectivamente.
Este protocolo proporciona soluciones con mayor accesibilidad, al tiempo que mantiene la flexibilidad para que estas herramientas especializadas se utilicen en aplicaciones posteriores.
Descripción general
Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (EM) para criomicroscopía tomográfica celular in situ y microscopía correlativa de luz y electrones (CLEM). El protocolo aborda los desafíos en la preparación de rejillas, asegurando la adhesión celular y minimizando el daño a la capa de carbono.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Microscopía electrónica
Antecedentes
- La tomografía electrónica criogénica directa de células es una herramienta poderosa para la investigación biológica.
- La preparación de las rejillas es fundamental para obtener imágenes y análisis exitosos.
- Los métodos actuales a menudo requieren equipos especializados, lo que limita su accesibilidad.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar el proceso manteniendo la flexibilidad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una metodología reproducible y accesible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica.
- Mejorar la utilidad de la tomografía crioelectrónica en estudios biológicos.
- Abordar los desafíos comunes relacionados con la adhesión celular y la integridad de las rejillas.
Métodos Utilizados
- Tratamiento con descarga de gas para mejorar la adhesión celular en rejillas.
- Aplicación de fibronectina bovina para promover la adhesión celular.
- Siembra celular y procedimientos de transfección para clones moleculares de VIH.
- Congelación por inmersión de rejillas para imágenes de tomografía electrónica criogénica.
Resultados principales
- Adhesión exitosa de células a rejillas de ME con daño mínimo.
- Observación de células productoras de VIH mediante microscopía criogénica correlativa.
- Preservación efectiva de la integridad de la rejilla durante el proceso de preparación.
- Demuestra la reproducibilidad del protocolo en múltiples ensayos.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado mejora el acceso a la preparación de rejillas para microscopía electrónica.
- Permite el estudio efectivo de procesos celulares mediante tomografía electrónica criogénica.
- Las aplicaciones futuras pueden aprovechar este método para diversas investigaciones biológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación rigurosa de muestras para la criotomografía in situ de células de mamíferos es fundamental para permitir estudios estructurales de alta resolución en contextos celulares nativos. Este protocolo aborda cuellos de botella clave en el manejo de rejillas, la adhesión celular y la reproducibilidad, afectando directamente la confiabilidad del análisis por imágenes y los análisis integrales posteriores. Una mayor accesibilidad y estandarización en la preparación de muestras mejora la confianza predictiva y la toma de decisiones en investigaciones de descubrimiento temprano e investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la ultraestructura celular para la reducción de riesgos mecanicistas.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la preservación del entorno celular nativo.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de ensamblajes moleculares in situ.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara muestras biológicas validadas para flujos de trabajo de imágenes correlativas.
- Normaliza la preparación de rejillas para garantizar la reproducibilidad y resultados cuantitativos en imágenes.
- Mejora la preparación para cribado de alto contenido y plataformas integradas de microscopía.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los resultados de imagen con modelos celulares relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Permite la evaluación estructural de las interacciones virales y celulares en sistemas preclínicos.
- Facilita el avance ajustado al riesgo mediante la provisión de datos morfológicos de alta fidelidad.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este protocolo de preparación de muestras se integra en la interfaz entre la biología del descubrimiento y el imagenológico avanzado, apoyando flujos de trabajo desde estudios mecanicistas iniciales hasta la validación de modelos preclínicos.
- Biología de Descubrimiento: Proporciona una preparación reproducible de muestras para pruebas de hipótesis y aclaración de vías.
- Selección: Ofrece rejillas estandarizadas y de alta calidad para imágenes cuantitativas y desarrollo de ensayos.
- Análisis: Permite la obtención de datos estructurales sólidos para análisis comparativo entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Translacional: Conecta el descubrimiento con la investigación preclínica al mantener el contexto celular en los resultados de imagen.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo flexible y accesible, adaptable a diversos tipos celulares y modalidades de imagen.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la validación estructural de dianas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, la estandarización y la escalabilidad de los flujos de trabajo de preparación de muestras.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al reducir los fallos de imagen.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de dianas validadas estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, manejo de rejillas y técnicas de microscopía.
- Necesita acceso a dispositivos de descarga eléctrica, cabinas de seguridad biológica y equipos para congelación por inmersión.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la preparación reproducible de rejillas y una calidad constante en la obtención de imágenes.
- Adaptable a diversos tipos de células mamíferas adherentes, con modificaciones del protocolo según sea necesario.
- La fragilidad de las rejillas y su manipulación siguen siendo limitaciones prácticas que requieren un manejo cuidadoso.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
