Aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos frescos y congelados para la secuenciación multioma
13 de octubre de 2023
El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.
A medida que crece nuestro conocimiento de la biología tumoral y nuestro interés por comprender las complejidades de cómo las células interactúan dentro del tumor e influyen en los resultados de los pacientes, también ha aumentado la importancia de analizar células heterogéneas en todo el microambiente tumoral. La secuenciación multioma, que permite la adquisición de ARN de una sola célula y la secuenciación de ataque de la misma célula en forma de célula pareada, supone un avance significativo en este sentido. Sin embargo, la calidad de los datos obtenidos de estos experimentos depende en gran medida de la calidad de las condiciones experimentales y del material biológico introducido.
Este protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics. Este protocolo es fiable utilizando suspensiones unicelulares frescas o congeladas. Proporcionamos recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.
En este protocolo, utilizamos muestras de adenocarcinoma ductal pancreático humano, que son un tipo de foco de tejido primario en nuestro laboratorio. El cáncer de páncreas representa un tipo de tumor altamente desmoplásico, que presagia tejido y células relativamente pegajosas. Además, dado que los especímenes de tumores pancreáticos disponibles para la investigación también tienden a ser relativamente pequeños, se realizan esfuerzos para maximizar la cantidad de células capturadas.
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Resumen
Este protocolo describe un método fiable y optimizado para aislar núcleos de muestras de tumores sólidos destinados a secuenciación multi-ómica utilizando la plataforma 10x Genomics. Incluye recomendaciones sobre condiciones de disociación del tejido y criopreservación de suspensiones individuales de células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Genómica
Antecedentes
- Comprender la biología tumoral es fundamental para mejorar los resultados en los pacientes.
- El análisis de células heterogéneas en el microentorno tumoral es cada vez más importante.
- La secuenciación multi-óm permite la adquisición emparejada de ARN unicelular y secuenciación ATAC.
- La calidad de los datos depende en gran medida de las condiciones experimentales y del material biológico.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para el aislamiento de núcleos a partir de tumores sólidos.
- Mejorar la calidad de los datos de secuenciación multi-ómica.
- Facilitar el análisis de los microentornos tumorales.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos.
- Uso de suspensiones de células individuales frescas o congeladas.
- Recomendaciones para las condiciones de disociación del tejido.
- Técnicas de criopreservación para suspensiones de células individuales.
Resultados principales
- Se estableció un enfoque optimizado para el aislamiento de núcleos.
- Se obtuvieron resultados confiables tanto de muestras frescas como congeladas.
- Mejoró la calidad de los datos para la secuenciación multi-ómica.
- Se proporcionaron pautas para el procesamiento de tejidos y la criopreservación.
Conclusiones
- El protocolo mejora la confiabilidad del aislamiento de núcleos a partir de tumores.
- Apoya el avance de las técnicas de secuenciación multi-ómica.
- Estudios futuros pueden beneficiarse de condiciones experimentales mejoradas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento optimizado de núcleos a partir de muestras de tumores sólidos es fundamental para generar datos de secuenciación multiómica de alta calidad, afectando directamente la fiabilidad de los análisis de heterogeneidad tumoral en oncología traslacional. Este protocolo aborda el desafío de extraer núcleos intactos tanto de tejidos tumorales desmoplásicos frescos como congelados, facilitando un perfilado multiómico robusto a nivel de célula individual. Una preparación confiable de núcleos en esta etapa mejora la confianza predictiva en los flujos de trabajo posteriores de descubrimiento y desarrollo de biomarcadores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación de alta fidelidad de la heterogeneidad de las células tumorales a nivel individual.
- Apoya la validación funcional de dianas al preservar diversas poblaciones celulares durante el aislamiento.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante una representación precisa del microambiente tumoral.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona preparaciones estandarizadas de núcleos para ensayos de secuenciación multiómica reproducibles.
- Asegura la consistencia cuantitativa y cualitativa del material de entrada para flujos de trabajo posteriores.
- Mejora la idoneidad del ensayo al acomodar tanto muestras tumorales frescas como criopreservadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con el descubrimiento translacional de biomarcadores al permitir el perfilado emparejado de ARN y accesibilidad de cromatina.
- Mantiene la relevancia para la enfermedad al capturar la complejidad de los microentornos de tumores sólidos.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la estandarización de la calidad de la muestra de entrada.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de aislamiento de núcleos se sitúa en la interfaz entre el procesamiento de tejidos y la generación de datos multiómicos, conectando los flujos de trabajo de descubrimiento inicial y de investigación traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Maximiza el poder de prueba de hipótesis al preservar la diversidad y la integridad celular.
- Tamizaje: Proporciona núcleos reproducibles y de alta calidad para ensayos de secuenciación multiómica escalables.
- Análisis: Permite lecturas cuantitativas robustas para comparar estados de células tumorales y paisajes de cromatina.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante análisis emparejados de ARN unicelular y secuenciación ATAC.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado y adaptable para diversos tipos de tumores sólidos y condiciones de muestras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los estudios de biología tumoral y validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad en muestras tumorales frescas y congeladas.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de pérdida de datos o introducción de artefactos en la etapa de preparación de muestras.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo de programas de descubrimiento y traslación en oncología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disociación de tejidos y el manejo de núcleos para obtener un rendimiento y calidad óptimos.
- Exige acceso a reactivos especializados, filtros celulares y herramientas de evaluación cuantitativa.
- Necesita la estandarización entre equipos de las condiciones de digestión y lisis para garantizar la reproducibilidad.
- Debe adaptarse a diferentes tipos de tumores y tamaños de muestra, especialmente en tejidos desmoplásicos.
- Es fundamental monitorear cuidadosamente la integridad nuclear para evitar artefactos en el secuenciamiento posterior.
