Automatización del cribado por criomicroscopía electrónica en múltiples redes con Smart Leginon
1 de diciembre de 2023
El cribado multirred de criomicroscopía electrónica (crioEM) suele ser un proceso tedioso que exige horas de atención. Este protocolo muestra cómo configurar una colección estándar de Leginon y Smart Leginon Autoscreen para automatizar este proceso. Este protocolo se puede aplicar a la mayoría de las rejillas de lámina con agujeros crioEM.
En el Centro de Microscopía Electrónica Simons, nuestro objetivo es proporcionar excelentes servicios, experiencia y capacitación en microscopía electrónica a investigadores locales y nacionales, y desarrollar métodos innovadores para optimizar los flujos de trabajo. Nuestro alcance abarca el servicio, el desarrollo, el aprendizaje automático y la investigación biomédica. Estamos tratando de responder, ¿cómo podemos optimizar mejor nuestros servicios?
El aprendizaje automático está cambiando el campo de la microscopía electrónica. La recopilación de datos se está automatizando. Las herramientas de análisis de datos son cada vez más eficientes.
Esto incluye la eliminación de ruido de las imágenes, la selección de partículas, el análisis de flexibilidad 3G y la creación de modelos. Actualizamos regularmente el software para tener en cuenta diferentes situaciones, como diferentes agujeros en la red, recolección inclinada o errores identificados a través del software de prueba beta en nuestro entorno de producción. También integramos los comentarios de nuestros usuarios, por lo que proporcionamos continuamente funciones que son útiles para ellos.
Smart Leginon aborda las tareas laboriosas y que requieren mucho tiempo y de cribado de una o más rejillas en un crioTEM. Permite a los operadores e investigadores examinar y analizar las cuadrículas más rápidamente, al tiempo que libera tiempo para optimizar las condiciones de la cuadrícula y la muestra en paralelo. Esto también reduce el tiempo y el costo del microscopio.
La pantalla automática Smart Leginon ofrece una detección de múltiples cuadrículas totalmente desatendida, que tarda unos 10 minutos en configurar la detección para 12 cuadrículas. En comparación con el cribado manual, nuestro protocolo ahorra varias horas al día. Desde la introducción de Smart Leginon, se han desarrollado otros programas gratuitos y comerciales para una automatización similar.
Resumen
Este protocolo describe la automatización del cribado multipantalla de microscopía electrónica criogénica (crioEM) mediante Smart Leginon Autoscreen. Al simplificar el proceso de configuración, los investigadores pueden reducir significativamente el tiempo dedicado al cribado de pantallas, lo que permite un análisis más eficiente y la optimización de las condiciones de la muestra.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microscopía electrónica criogénica
- Automatización en microscopía
- Análisis de imágenes
Antecedentes
- El cribado múltiple de rejillas en microscopía electrónica criogénica tradicionalmente es intensivo en mano de obra.
- La automatización puede mejorar la eficiencia y reducir costos.
- Smart Leginon Autoscreen facilita el cribado sin supervisión.
- El aprendizaje automático está mejorando la recopilación y el análisis de datos en microscopía electrónica.
Objetivo del estudio
- Automatizar el proceso de cribado de múltiples rejillas en microscopía electrónica criogénica (cryoEM).
- Reducir el tiempo y el esfuerzo asociados al análisis de rejillas.
- Optimizar los flujos de trabajo para investigadores en microscopía electrónica.
Métodos Utilizados
- Configuración de la interfaz Leginon para cribado automatizado.
- Configuración de diversos parámetros de enfoque y exposición.
- Uso de la aplicación Ptolemy para el procesamiento de imágenes.
- Integración de las opiniones de los usuarios para la mejora continua.
Resultados principales
- Smart Leginon Autoscreen reduce el tiempo de cribado en varias horas diarias.
- Los operadores pueden cribar múltiples rejillas de forma eficiente.
- La automatización permite la optimización paralela de las condiciones de la rejilla y de la muestra.
- Actualizaciones continuas del software mejoran la funcionalidad según las necesidades del usuario.
Conclusiones
- La automatización en criomicroscopía electrónica mejora significativamente la eficiencia del flujo de trabajo.
- Smart Leginon Autoscreen es una herramienta valiosa para los investigadores.
- Es probable que los futuros desarrollos continúen mejorando la automatización y el análisis de datos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cribado automatizado de rejillas mediante microscopía electrónica criogénica (crioEM) utilizando Smart Leginon aborda un cuello de botella crítico en los flujos de trabajo de biología estructural y descubrimiento de biofármacos. Al reducir el tiempo del operador y aumentar el rendimiento, esta automatización mejora la eficiencia del descubrimiento temprano de fármacos basado en estructuras y la validación de dianas. El enfoque permite un cribado escalable y reproducible en múltiples rejillas, apoyando una toma de decisiones robusta en puntos clave de inflexión del proceso de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Acelera la interrogación estructural de complejos macromoleculares para la validación de objetivos.
- Permite la optimización rápida de las condiciones de muestra y rejilla, reduciendo la ambigüedad experimental.
- Apoya la confianza predictiva en las hipótesis estructurales para la clasificación de carteras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara rejillas de criomicroscopía electrónica validadas para flujos de trabajo posteriores de recopilación de datos de alta resolución.
- Normaliza el cribado de rejillas, mejorando la reproducibilidad y la evaluación cuantitativa de la calidad de la muestra.
- Facilita un cribado escalable y sin supervisión para permitir una evaluación confiable de múltiples condiciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona información estructural que orienta la alineación de biomarcadores traslacionales cuando es pertinente.
- Asegura la continuidad desde el cribado en fase de descubrimiento hasta la validación estructural preclínica.
- Reduce el riesgo al permitir la identificación temprana de las condiciones óptimas de la muestra para el desarrollo posterior.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Smart Leginon Autoscreen se integra en el continuo de descubrimiento desde la optimización inicial de muestras hasta la identificación de compuestos activos y la validación estructural preclínica.
- Biología de Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la realización rápida y reproducible de cribados en cuadrícula.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados para comparar condiciones de cuadrículas y muestras.
- Análisis: Ofrece imágenes de alto contenido y resultados estadísticos para guiar la selección de cuadrículas destinadas a la recopilación de datos de alta resolución.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad estructural para estudios de biomarcadores y mecanismos cuando el flujo de trabajo lo respalda.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de automatización escalable y reutilizable para satisfacer las necesidades de cribado de múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios estructurales.
- Valor operativo: Estandariza y escala el cribado de cuadrículas, reduciendo el tiempo del operador de horas a minutos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más acertadas de avance/no avance y una mayor eficiencia del capital al acelerar la validación estructural en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas validadas estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de muestras de criomicroscopía electrónica y optimización de rejillas.
- Depende del acceso a instrumentación automatizada de criomicroscopía electrónica y a una infraestructura de software compatible.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de cribado y del manejo de datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos de rejillas o clases de muestras, según lo admita el software.
- Las limitaciones prácticas incluyen la disponibilidad del microscopio y la configuración inicial para flujos de trabajo automatizados.
