Determinación de la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana del epitelio pseudoestratificado de la vía aérea pulmonar
21 de febrero de 2025
El cultivo de la interfaz aire-líquido se usa comúnmente para desarrollar epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias mediante la diferenciación de células epiteliales bronquiales humanas normales primarias que imitan el lado apical de las vías respiratorias pulmonares. Aquí, describimos un protocolo sencillo para determinar su calidad mediante el monitoreo de sus propiedades biofísicas, como la función ciliar y la integridad de la membrana.
Nuestra investigación tiene como objetivo medir dos propiedades biofísicas críticas del epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias, que se pueden obtener diferenciando células epiteliales bronquiales humanas normales en una interfaz aire-líquido. Identificamos diferentes características de diferentes virus respiratorios mediante el uso de epitelio pseudoestratificado de la vía aérea. Por ejemplo, la inflamación del citoesqueleto provocada por el virus respiratorio sincitial, que es un mecanismo no canónico de la bronquiolitis.
También identificamos que la hiperplasia de células caliciformes aumenta la replicación del SARS-CoV-2 en el epitelio de las vías respiratorias por enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Nos centramos en dilucidar el mecanismo de modulación de la señalización del citoesqueleto impulsada por el virus respiratorio sincitial para identificar nuevas dianas terapéuticas para combatir la infección por VRS y la bronquiolitis inducida por virus. Para comenzar, tome una suspensión de células epiteliales bronquiales humanas normales, o NHBE.
Con una pipeta P200, añada 50.000 células resuspendidas en 200 microlitros de medio completo de células epiteliales de las vías respiratorias, o AEC, en el lado apical del inserto. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono humidificado al 85% y al 95%. Una vez que las células estén confluentes, transfiera los insertos a un pocillo vacío con pinzas estériles.
Con una pipeta P1000, aspire todo el medio AEC basal. A continuación, se añadan 500 microlitros de medio de diferenciación completo de ALI fresco suplementado con 2% de penicilina-estreptomicina y 1% de anfotericina B al pocillo basal. Con pinzas estériles, transfiera los insertos al pocillo basal con el medio ALI completo agregado.
Con una pipeta P200, aspire suavemente el medio AEC apical del pocillo e incube. Después de 48 horas, transfiera los insertos a un pocillo vacío con pinzas estériles. Con una pipeta P1000, aspire el medio antiguo y añada 500 microlitros de medio ALI completo fresco.
Vuelva a colocar los insertos en el pocillo con medio fresco utilizando pinzas estériles. El día 26, con una pipeta P200, añadir 100 microlitros de DPBS en la cara apical de los insertos. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificada durante 30 minutos.
A continuación, aspire el DPBS con una pipeta P200. Para comenzar, encienda el microscopio, la computadora conectada y la cámara de entorno. Abra la puerta de la cámara y coloque la placa que contiene los insertos con células NBHE en la platina del microscopio.
Una vez que la placa esté en el escenario, cierre la cámara. Luego, use la perilla de operación de la platina del microscopio para mover la placa y mostrar los insertos. En la pantalla de la computadora, haga clic en el icono del sistema SAVA para abrir el programa SAVA.
En la interfaz del software, haga clic en Configurar experimento. En la siguiente pestaña, haga clic en Crear experimento. A continuación, en la nueva pestaña, introduzca el directorio en el que se almacenarán los datos en el campo Introducir nombre del directorio del experimento y proporcione detalles en el campo Introducir descripción del experimento y, a continuación, haga clic en Aceptar. Ahora, haga clic en el experimento que se creó y se muestra en el directorio en la sección Experimentos.
A continuación, haga clic en Modificar y proporcione los detalles de la muestra en el campo Descripción de la muestra. Haga clic en Agregar y, a continuación, haga clic en Salir para salir de la pestaña. En la interfaz principal del software, seleccione el experimento creado en el menú desplegable de la ranura Experimento.
Luego, haga clic en Grabar video para monitorear la frecuencia de latido ciliar en la pantalla de la computadora. La pantalla mostrará el movimiento ciliar enfocado. Para cada inserción, grabe seis campos aleatorios diferentes durante 2,1 segundos a 120 fotogramas por segundo.
Haga clic en Guardar video para monitorear los datos de frecuencia de latido ciliar. Para analizar los datos, haga clic en Analizar video en la interfaz del software. Y en la siguiente pestaña, haga clic en Aceptar. Luego vaya a la siguiente pestaña y haga clic en Analizar todo.
Descargue la hoja de cálculo generada para cada experimento en la carpeta Adquisición de datos SAVA del equipo. Tome la frecuencia media gaussiana para la presentación de datos. La frecuencia de los latidos ciliares alcanzó al menos tres hercios tanto para el epitelio de las vías respiratorias de los adultos sanos como para los pacientes con EPOC, mostrando una función ciliar comparable.
Para comenzar, encienda el ohmímetro EVOM2 voltios usando el interruptor de encendido. Conecte la resistencia de prueba al EVOM2 en la ranura de entrada. Supervise la lectura en la pantalla EVOM2.
Si la lectura está por encima o por debajo de 1.000, gire el interruptor ADJ en el EVOM2 con pinzas hasta que muestre una lectura uniforme de 1.000 para calibrar el dispositivo. Ahora, tome un inserto vacío para la lectura de control experimental. Con una pipeta P200, añada 100 microlitros de DPBS en el lado apical del inserto vacío.
A continuación, añada 500 microlitros de DPBS en el lado basal con una pipeta P1000. A continuación, desconecte la resistencia de prueba y conecte el electrodo STX2 a la ranura de entrada del EVOM2. A continuación, limpie suavemente el electrodo STX2 con etanol al 70%.
Inserte el electrodo STX2 en el inserto vacío con DPBS, manteniendo la pata del electrodo más corta en la parte apical y la pata del electrodo más larga en la parte basal. Ahora, registre la lectura estable en la pantalla EVOM2. A continuación, con una pipeta P200, añada 100 microlitros de DPBS en el lado apical del inserto.
Inserte el electrodo STX2 en el inserto con el epitelio diferenciado de las vías respiratorias de 26 días, como se muestra anteriormente. A continuación, registre la lectura estable en la pantalla EVOM2. Los valores de resistencia eléctrica transepitelial aumentaron en adultos con EPOC, lo que indica una mayor impermeabilidad de la membrana en la EPOC.
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Descripción general
Este estudio se centra en el desarrollo de un epitelio respiratorio pseudoestratificado utilizando células epiteliales bronquiales humanas normales diferenciadas en una interfase aire-líquido (ALI). La investigación destaca un método para evaluar la calidad de este modelo epitelial mediante el monitoreo de sus propiedades biofísicas, particularmente la función ciliar y la integridad de la membrana, que son fundamentales para comprender las infecciones virales respiratorias.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Epitelio respiratorio pseudoestratificado
- Virus respiratorios
- Complicaciones de bronquiolitis y EPOC
Antecedentes
- El cultivo en interfase aire-líquido imita las características de las vías respiratorias pulmonares.
- El virus respiratorio sincitial (VRS) exhibe mecanismos inflamatorios no canónicos.
- Hiperplasia de células caliciformes y su impacto en la replicación del SARS-CoV-2.
Métodos Utilizados
- Protocolos de diferenciación celular y técnicas de monitoreo
- Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE)
- Videomicroscopía para evaluar la frecuencia del latido ciliar; resistencia eléctrica transepitelial para evaluar la integridad de la membrana
Resultados Principales
- La frecuencia de latido de los cilios alcanzó tres hercios tanto en adultos sanos como en pacientes con EPOC, lo que indica una función ciliar comparable.
- Los valores de resistencia transepitelial sugieren una mayor impermeabilidad de la membrana en la EPOC.
- Se identificó la modulación del citoesqueleto inducida por el VSR y sus implicaciones para el diseño de tratamientos terapéuticos.
Conclusiones
- El estudio establece con éxito un método confiable para evaluar cultivos de epitelio respiratorio.
- Los hallazgos proporcionan información esencial sobre la fisiopatología de las infecciones virales respiratorias y sus implicaciones en enfermedades crónicas como la EPOC.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana en el epitelio respiratorio pseudoestratificado proporciona un control de calidad crítico para modelos respiratorios preclínicos. Estas mediciones biofísicas sustentan la confianza predictiva en sistemas relevantes para enfermedades en la investigación de virus respiratorios y la validación de dianas terapéuticas. La medición confiable de la frecuencia de batido ciliar y la resistencia transepitelial apoya el avance ajustado al riesgo de los modelos de vía aérea a lo largo de las fases de descubrimiento y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de modelos epiteliales de vías respiratorias para la investigación de enfermedades respiratorias.
- Apoya la desactivación mecanicista de riesgos mediante la cuantificación de la actividad ciliar y la integridad de la barrera.
- Facilita la identificación de nuevos blancos terapéuticos mediante fenotipificación relevante a la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona métricas estandarizadas y reproducibles para evaluar la idoneidad del ensayo en modelos de vías respiratorias.
- Genera resultados cuantitativos (FCB, RTEE) esenciales para los flujos de trabajo de cribado de compuestos.
- Asegura la calidad del sistema biológico para una evaluación confiable posterior de agentes antivirales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea modelos de vías aéreas in vitro con puntos finales relevantes para la enfermedad, para una continuidad traslacional.
- Permite estudios comparativos del epitelio sano y enfermo, apoyando el desarrollo de biomarcadores.
- Reduce el riesgo traslacional mediante la validación de la integridad del modelo antes de los estudios preclínicos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este método ancla la calificación del modelo de vía aérea desde el descubrimiento temprano hasta la investigación preclínica, apoyando tanto la validación del blanco como los puntos de inflexión en el cribado.
- Biología del Descubrimiento: Las mediciones cuantitativas del CBF y de la TER clarifican el estado funcional y la relevancia biológica de los modelos de vía aérea.
- Selección: Los resultados estandarizados permiten el desarrollo de ensayos reproducibles y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Los videos de alta velocidad y las lecturas voltio-óhmicas proporcionan datos objetivos y comparables entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Las mediciones relevantes para la enfermedad apoyan la alineación con los puntos finales clínicos y las estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: El protocolo establece una plataforma reutilizable para la investigación de virus respiratorios y enfermedades de la vía aérea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de enfermedades respiratorias.
- Valor operativo: Proporciona métricas estandarizadas, escalables y reproducibles de control de calidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance y la asignación de capital al garantizar la fiabilidad del modelo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de los programas de investigación respiratoria.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo y diferenciación de células epiteliales de vías respiratorias.
- Necesita acceso a videomicroscopía de alta velocidad e instrumentación voltio-óhmica.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de medición y del análisis de datos.
- Puede requerir adaptación para diferentes fuentes de donantes o modelos de enfermedad.
- Depende de la calidad constante de las células y del control ambiental para lograr reproducibilidad.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Introduction
1:10
Establishing Air Liquid Interface (ALI) Culture to Develop Pseudostratified Airway Epithelium
3:07
Determination of Ciliary Beat Frequency of the Airway Epithelium Obtained from Differentiating Primary NHBE Cells
5:37
Quantification of Transepithelial Electrical Resistance of Air Liquid Interface‐Cultured Pseudostratified Airway Epithelium
