Producción basada en microbioreactores de células estromales mesenquimales dependientes del anclaje, preparadas para el síndrome de dificultad respiratoria aguda

Estudiamos cómo interactúan las células con su entorno, incluyendo la producción o fabricación de células como terapias. Aquí abordamos preguntas sobre cómo pueden producirse células dependientes del anclaje como las MSC, el estromala mesenquimalesa o las células madre, para superar algunas barreras a la traducción clínica. El creciente reconocimiento de que la variabilidad de la población celular afecta tanto a la consistencia como a la potencia del producto celular final para cada lote o persona.

Estos desafíos pueden incluso afectar la aprobación regulatoria de algunas terapias celulares. Apuntamos a una brecha que pueda alcanzar un alto número de células por mililitro de fluido con un alto control del entorno y de una manera que pueda escalarse. Este protocolo permite incluir monitorización ambiental en línea para células que dependen del anclaje, como las MSC.

Ese control de procesos es una ventaja frente a los frascos que todavía se utilizan en la mayoría de la producción de laboratorio y clínica. Hay varias preguntas abiertas para los MSC y otros tipos celulares sensibles a señales mecánicas. Por ejemplo, ¿cómo puede este tipo de enfoque ayudar a diseñar células para abordar otros estados patológicos?

Para empezar, quita la tapa de plástico transparente conectada a la botella LL en el estante. Usando una jeringuilla estéril nueva de 50 mililitros sin émbolo, conecta la boquilla a la botella LL. Vierte el agua filtrada estéril en el barril de la jeringuilla e inyecta en la botella LL. De igual forma, llena la botella L con 25 mililitros de DMEM bajo en glucosa sin FBS, la botella R con 25 mililitros de PBS estéril y la botella RR con ocho mililitros de solución antiadherente para enjuagar. Repite el procedimiento para preparar el número requerido de consumibles para el experimento.

A continuación, realiza una autoprueba en cada cápsula que se usará en el experimento. Una vez que el pod haya superado todas las comprobaciones de la autoprueba, retira los casetes de autoevaluación y colócalos en bolsas de almacenamiento protegidas de la luz. Monta el consumible en el biorreactor.

Quita la cinta verde de las válvulas de consumibles e instala el consumible en la cápsula. Reinstala las abrazaderas y comprueba si hay algún siseo para confirmar que el sello está seguro. Conecta la línea blanca del sensor de presión, la línea de presión de aire rojo y la línea azul de vacío entre el consumible y la estación base o cápsula.

Confirma que el puerto de inyección lateral está cerrado con una pinza blanca en forma de lágrima antes de iniciar un nuevo experimento. Haz clic en el icono de Flush Bottles en la interfaz del software. Activa el botón de radio para la botella L, selecciona Salida a Residuos y luego haz clic en Iniciar Vaciar MSCserum.

En la ventana de Contenido de la botella, indica que MSCserum se encuentra en la botella R, que contiene PBS. Luego navega a Operaciones Manuales y realiza tres ciclos de Expulsión y Lavado en la botella de residuos. En la ventana de Contenido de la botella se indica que MSCserum ahora se encuentra en la botella RR, que contiene la solución antiadherente para enjuagar.

Vuelve a Operaciones Manuales y realiza un ciclo de Expulsión y Lavado en la botella de desechos. Después de 30 minutos, enjuaga el consumible con PBS. Vacía el reactor esperando la inyección de células y microportadores.

En el panel de Operaciones Manuales haz clic en Reinocular. Deja el sistema pausado en la fase en la que el panel muestra una invitación para inocular el reactor. A continuación, se pipeta un volumen calculado de células resuspendidas en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene microportadores para cada condición.

Rellena cada tubo con entre 2,2 y 2,5 mililitros con medios frescos y calientes de células madre mesenquimales humanas. Trabajando con uno o dos consumibles a la vez, sácalos de la estación base y llévalos al armario de bioseguridad. Retira la mezcla de célula y microportador en una jeringuilla de cinco mililitros usando una aguja verde roma de cuatro pulgadas.

Inyecta la mezcla en el reactor. Sujeta la línea del puerto de inyección cerca de la base del casete con cuidado de no desprender la línea. Usando un movimiento de rodado entre el pulgar y el índice, gira la línea del puerto de inyección durante dos vueltas completas para crear un nudo en la línea.

Mete el nudo en el espacio de corte cerca de la base del puerto de inyección y fíjalo con un pequeño trozo de cinta de laboratorio. Luego devuelven el consumible a la estación base. Tras repetir la inyección para todos los consumibles, navega por la interfaz del software para indicar que la inoculación ha terminado.

Cuando el software regrese a la página principal, retira la pinza blanca de las líneas de salida de los consumibles. Entra en Manual Ops y realiza la función de Expulsar exceso con el puerto de salida configurado a P para perfusión. Activa el modo de mezcla estática usando un ciclo de 1.680 segundos encendido y 120 segundos apagado, y ajusta la frecuencia de mezcla a cinco hertzios.

Para comenzar la extracción celular, utiliza una jeringuilla de un mililitro para extraer 200 microlitros de Pronasa y aproximadamente entre 300 y 400 microlitros de aire. Desatornilla la tapa de la línea de inyección del puerto lateral y rocía el conector de la válvula sin aguja con etanol al 70%. Quita la cinta de la línea de inyección del puerto lateral anudado, desata el nudo y desabraza la abrazadera blanca en forma de gota.

Ahora, conecta la jeringuilla de un mililitro e inyecta suavemente la Pronasa en el reactor. Aprovecha el líquido con aire para asegurar la entrega completa. Reengancha la abrazadera en forma de lágrima y vuelve a tapar la línea de inyección.

Luego devuelvo el consumible a la cápsula, reconecto todas las líneas, quita la pinza blanca en C y continúa mezclando. Coloca la botella de residuos y la botella de la fuente de medios sobre hielo. Inicia un temporizador de cinco minutos y deja que la Pronasa digiera los microportadores del reactor.

Tras cinco minutos, verifica que los microportadores se han degradado comprobando su ausencia en el reactor. Extrae las celdas entrando en Operaciones Manuales, pon el número de ciclos en tres, elige Puerto de salida W para residuos y haz clic en Expulsar Lavado. Una vez completados los ciclos de lavado de expulsión, transfiere el consumible al armario de bioseguridad.

Luego retira el contenido del frasco de residuos usando una jeringuilla de 10 o 20 mililitros. Dispensa el contenido de la botella de residuos en un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugadora. Centrifuga las celdas a 300g durante cinco minutos.

Aspira el sobrenadante y evalúa el tamaño de la pelota celular. Las condiciones ambientales, incluyendo pH, temperatura, oxígeno disuelto y dióxido de carbono, se mantuvieron de forma estable durante el periodo de cultivo de 10 días en el sistema microbioror. La variación del pH fue significativamente menor en el microbioreactor en comparación con la condición de matraz de poliestireno en cultivo tisular.

El rendimiento celular fue mayor en el microbioreactor que en el matraz T25, manteniendo una viabilidad celular similar. De los 14 atributos críticos de calidad asociados a la potencia medidos, nueve mostraron una expresión significativamente mayor de ARNm en la condición del microbioreactor en comparación con el matraz T75.