Una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas de semen equino criopreservado como donantes nucleares para clonación
19 de diciembre de 2025
Este protocolo presenta una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas (SC) viables a partir del semen equino criopreservado. A diferencia de los enfoques tradicionales, esta técnica evita cultivos in vitro prolongados y supera la contaminación de espermatozoides, permitiendo su uso inmediato en la clonación de células somáticas.
Nuestro objetivo es demostrar que las células somáticas del semen equino criopreservado pueden ser útiles para recuperar individuos de alto valor genético. Nuestro desafío actual es poder seleccionar células somáticas con ADN diploide intacto para ser utilizadas como donantes nucleares. Para empezar, retira las pajitas de semen equino del tanque de nitrógeno líquido.
Exponérselos al aire durante 10 segundos y descongelarlos en un baño maria a 37 grados Celsius durante 30 segundos. Toma una muestra de 250 microlitros del semen descongelado. Diluíra con un mililitro de medio DMEM-F12 suplementado.
Incuba la mezcla de semen a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Pipetear 25 microlitros de la dilución incubada en un tubo y diluirlo en 975 microlitros de DPBS suplementado con 0,1 miligramos por mililitro de alcohol polivinílico o polivinil pirrolidona. Mezcla suavemente la suspensión.
Mantén la mezcla de semen diluida a 37 grados Celsius durante todo el proceso de recogida celular. Colocar una tapa de placa de Petri que contenga semen equino diluido en el escenario del microscopio para preparar la recogida de células somáticas. Seleccione una micropipeta de diámetro adecuado para la recogida de células somáticas y conéctala al sistema mecánico de aspiración.
Inserta cuidadosamente la micropipeta en la microgota y alínea la base con la tapa del plato. Una vez que la pipeta aspira el medio de cultivo, comienza la captura individual de células somáticas. Céntrate en la parte inferior de la microcaída, donde se pueden ver varias morfologías celulares.
Coloca la punta de la micropipeta junto a cada célula somática y aspira bajo presión negativa. Recoge todas las células redondas y alargadas, independientemente del tamaño. Después de recoger 10 células, depositalas en una microgota de 10 microlitros situada en la superficie superior de la tapa del plato.
Conserva todas las células somáticas recogidas dentro de esta micro gota durante todo el proceso de recogida. Una vez recogida la cantidad deseada de células somáticas, realiza un procedimiento sencillo de lavado utilizando microgotas para eliminar esperma, residuos y contaminantes microbianos. Utilizando una segunda tapa para platos, realiza un lavado secuencial de tres pasos de las células somáticas.
Utiliza una micropipeta para transferir las células somáticas a la primera gota y déjalas reposar entre tres y cinco minutos. Transfiere las células de la primera gota a la segunda usando el mismo procedimiento. Repite la transferencia una vez más y coloca las células somáticas en la tercera gota.
Finalmente, depositar las células somáticas aisladas en una microgota preparada designada para la transferencia nuclear de células somáticas. La técnica de microaspiración recuperó con éxito células somáticas de semen equino criopreservado, con tasas de captura que oscilaban entre 317,7 y 424,7 células por hora en tres sementales. El semental número 3 muestra el mayor rendimiento.
Se identificaron cinco tipos celulares somáticas distintos basándose en tamaño y morfología. Identificamos una población de células somáticas que difiere en morfología y viabilidad en semen equino criopreservado, lo cual puede ser útil como donante nuclear. Las células pueden seleccionarse en función de su morfología, y el procedimiento no requiere el establecimiento de un cultivo primario.
Nos centraremos en mejorar la viabilidad de estas células tras el volumen del semen equino.
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Descripción general
Este protocolo presenta una técnica de microaspiración para aislar células somáticas viables a partir de semen equino criopreservado. Este método evita los cultivos in vitro prolongados y la contaminación con espermatozoides, lo que permite su uso inmediato en la clonación de células somáticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología reproductiva
Antecedentes
- Las células somáticas pueden obtenerse de semen equino criopreservado.
- El aislamiento de células somáticas viables es fundamental para fines de clonación.
- Los métodos tradicionales suelen implicar tiempos prolongados de cultivo.
- La contaminación por espermatozoides puede dificultar el proceso de clonación.
Objetivo del estudio
- Demostrar una técnica para aislar células somáticas del semen equino.
- Permitir el uso de estas células para clonar individuos de alto valor genético.
- Asegurar que las células somáticas seleccionadas tengan ADN diploide intacto.
Métodos Utilizados
- Descongelación de pajuelas de semen equino provenientes de nitrógeno líquido.
- Uso de un baño de agua a 37 grados Celsius para la descongelación.
- Muestreo y dilución del semen descongelado con medio DMEM-F12 suplementado.
- Aplicación de una técnica de microaspiración para el aislamiento celular.
Resultados Principales
- Aislamiento exitoso de células somáticas viables.
- Reducción de la contaminación por espermatozoides en el proceso.
- Usabilidad inmediata de las células aisladas para clonación.
- Preservación de la integridad del ADN diploide en las células seleccionadas.
Conclusiones
- La técnica de microaspiración es eficaz para el aislamiento de células somáticas.
- Este método mejora el potencial de clonación de células somáticas en equinos.
- Aplicaciones futuras podrían conducir a una mejor recuperación genética en la cría de equinos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La recuperación eficiente de células somáticas viables a partir de semen equino criopreservado aborda un cuello de botella crítico en la utilización de recursos genéticos para tecnologías reproductivas avanzadas. Esta técnica de microaspiración permite el acceso inmediato a células donantes diploides para la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), evitando la necesidad de cultivos prolongados y reduciendo la contaminación espermática. El enfoque amplía el potencial de rescate genético y de diversificación de portafolios en las líneas de biotecnología animal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la viabilidad de células somáticas y del estado diploide a partir de muestras criopreservadas.
- Apoya la validación funcional de la idoneidad del donante nuclear para flujos de trabajo de TCNS.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante la selección morfológica de células donantes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un método rápido y reproducible para aislar células somáticas libres de interferencia espermática.
- Proporciona poblaciones estandarizadas de células para ensayos de clonación posteriores sin necesidad de establecer cultivos primarios.
- Permite la evaluación cuantitativa del rendimiento celular y la morfología para la optimización del proceso.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Mejora la continuidad desde el banco de recursos genéticos hasta las aplicaciones preclínicas de clonación.
- Se alinea con los objetivos traslacionales al permitir la recuperación de genotipos de alto valor a partir de material archivado.
- Reduce el riesgo biológico al garantizar la integridad de las células donantes antes de la generación de embriones.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de microaspiración se integra en la interfase entre la recuperación de recursos genéticos y el clonado basado en la transferencia nuclear de células somáticas, conectando el banco de criopreservación con la preparación inmediata del donante nuclear.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la viabilidad celular y la integridad genética de células donantes procedentes de fuentes criopreservadas.
- Selección: Estandariza el aislamiento de células somáticas para obtener una entrada reproducible en la TCNE.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa del rendimiento celular y de la diversidad morfológica.
- Investigación Traducional: Conecta el semen biobancado con flujos de trabajo de clonación aplicables para el rescate genético.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable para diversos orígenes genéticos y muestras archivadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la idoneidad de las células donantes y reduce la ambigüedad mecanicista en la TCNE.
- Valor operativo: Agiliza el aislamiento celular, mejora la reproducibilidad y elimina los prolongados pasos de cultivo.
- Valor estratégico: Permite decisiones rápidas de avance o interrupción en proyectos de recuperación genética y optimiza la asignación de recursos.
- Impacto en la cartera: Amplía el rango de material genético viable para clonación y estrategias de reproducción ajustadas al riesgo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en micromanipulación y evaluación de la morfología celular.
- Necesita acceso a sistemas mecánicos de aspiración e infraestructura de microscopía.
- Exige estandarización entre equipos para los procedimientos de selección y lavado celular.
- Es adaptable a diversas muestras de semen, aunque puede requerir optimización según la especie o las condiciones de preservación.
- La viabilidad celular tras el aislamiento puede variar y debe monitorizarse para determinar la idoneidad en la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT).
