Protocolo para la Disociación de Células Individuales, Secuenciación de ARN y Aislamiento de Células Mioepiteliales y Fibroblastos de las Glándulas Lagrimales y Salivales Envejecidas

Mi laboratorio estudia cómo los cambios relacionados con la edad en las glándulas salivales y lagrimales afectan a diferentes tipos celulares utilizando citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular. Los métodos estándar de disociación recuperan mal células epiteliales frágiles de las glándulas salivales y lagrimales envejecidas. Y mi protocolo mejora la viabilidad de las células y permite un análisis y clasificación de células únicas fiables.

Para empezar, coloca al ratón eutanasiado en recostado sobre la mesa de disección. Con pinzas finas y tijeras, incide la piel entre el ojo y el oído. Retrae suavemente la piel para exponer la glándula lagrimal.

Con pinzas de punta opaca, levanta ligeramente la glándula lagrimal. Separa cuidadosamente el tejido conectivo circundante desplazándolo suavemente en un movimiento circular. Identifica los límites visibles de la glándula lagrimal y sepárala de los tejidos adyacentes, incluida la glándula parótida.

Luego transfiere la glándula lagrimal a una placa de Petri de 35 milímetros que contiene dos mililitros de PBS frío sobre hielo. Bajo un microscopio disecador, retirar la grasa restante y retirar cuidadosamente la cápsula de tejido conectivo de la glándula lagrimal. Coloca una placa de Petri estéril de 35 milímetros sobre hielo.

Añade entre 800 y 1000 microlitros de PBS frío en el centro del plato y transfiere una glándula lagrimal al PBS. Asegúrese de que el tejido permanezca sumergido en PBS. Con dos bisturíes estériles, pica finamente la glándula lagrimalical en pequeños fragmentos hasta que alcance una consistencia suave y pasta.

Recoge los fragmentos de tejido a un lado del plato. Aspira el PBS residual y lava los fragmentos con un mililitro de PBS fresco y frío. Transfiere los fragmentos de tejido lavados a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros por pozo de medio digerente precalentado.

Coloca la placa en un baño maria agitante e incuba a 37 grados Celsius y 60 revoluciones por minuto durante 30 minutos. Utilizando una punta de pipeta de un mililitro de ánima ancha, tritura suavemente el tejido 15 veces. Vuelve a colocar el plato en el baño maria agitado y incuba durante 30 minutos más.

A continuación, usando una punta de piquita normal de un mililitro, tritura suavemente la muestra 10 veces y vuelve a incubar durante 30 minutos. Luego trituren suavemente la muestra 10 veces y transfieran la suspensión celular a tubos microcentrífugas dolphin de dos mililitros. Añade un mililitro de medio bloqueador en frío uno, o BM1, a cada pozo de la placa para recoger el medio digestivo restante que contiene células residuales y colocar la placa sobre hielo hasta el siguiente paso.

Centrifuga los tubos que contienen la suspensión de la celda a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Descarta el sobrenadante de cada tubo. Transfiere el BM1 de cada pozo de la placa que contiene las celdas residuales al tubo correspondiente.

A continuación, añade 600 microlitros de BM1 frío a cada pozo para enjuagar las celdas restantes y transfiere el lavado al tubo correspondiente para combinarlo con la suspensión de celdas. Suspende suavemente la suspensión de la celda. Centrifugar los tubos de nuevo a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descartar el sobrenadante.

Añade un mililitro de Accutase a los pellets celulares y resuspende suavemente las células. Incuba el tubo a 37 grados Celsius y 60 revoluciones por minuto durante cinco a diez minutos. Usando una punta de una pipeta de un mililitro, tritura suavemente la muestra 10 veces.

Luego añade un mililitro de BM2 frío al tubo para terminar la reacción enzimática diluyendo la Accutasa. Centrifuga el tubo a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y descarta el sobrenadante. Añadir un medio que contenga DNasa 1 a una concentración de 200 unidades por mililitro al tubo para volver a suspender las células y llenar el tubo hasta la parte superior.

Incuba el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente y vuelve a suspender suavemente una vez después de cinco minutos. Mientras tanto, coloca un colador de celda de 70 micrómetros sobre un tubo cónico de 15 mililitros y prehumedece el colador con un mililitro de BM3. Tras la incubación, transfiere la suspensión celular al colador.

Añade un mililitro de BM3 al tubo original para enjuagarlo y transfiere el enjuague al mismo colador. Lava el colador con cinco mililitros adicionales de BM3. Finalmente, determinar la concentración celular y la viabilidad de la suspensión filtrada mediante tinción azul tripánica y un contador celular automatizado.

Proceder con aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN unicelular para perfilado de expresión génica, o la clasificación celular basada en citometría de flujo de poblaciones celulares marcadas con fluorescencia. El análisis UMAP de datos de secuenciación de ARN unicelular identificó poblaciones epiteliales y estromales bien representadas en la glándula lacrimal, incluyendo células mioepiteliales y fibroblastos, así como diversas poblaciones de células inmunitarias. Las glándulas lacrimales envejecidas contenían abundante plasma y células B activadas que expresaban IGHM e IGHD.

La citometría secuencial de flujo permitió separar claramente las células mioepiteliales positivas para EpCAM y GFP positivas de las células mural negativas para EpCAM y positivas para GFP. Los fibroblastos positivos para GFP que expresaban PDGFR alfa eran negativos para EpCAM, permitiendo la discriminación de células epiteliales. En ratones PDGFR alfa y EGFP, todas las células positivas para GFP también expresaron colágeno uno, confirmando la identidad de los fibroblastos.

El análisis de citometría de flujo mostró que el 99,6% de las células positivas para GFP correspondían a células inmunotintadas por PDGFR alfa. Este protocolo está diseñado para aislar células individuales viables de glándulas lagrimales para la caracterización molecular de poblaciones epiteliales, estromales e inmunes. El principal desafío es minimizar el estrés mecánico y enzimático durante la disociación de tejido frágil y envejecido, al tiempo que se mantiene una alta viabilidad celular para la secuenciación de ARN unicelular.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar células aisladas para la secuenciación de ARN unicelular, la secuenciación de ARN a granel y el perfilado molecular de poblaciones celulares específicas. Las células clasificadas también pueden cultivarse para ensayos funcionales posteriores.