Un método para adaptar Euglena gracilis a sustratos basados en yuca para cultivo heterotrófico

Nuestra investigación se centra en adaptar las nuevas hojas de Euglena gracilis a los desechos de yuca y en estudiar el crecimiento, la reducción de cianuros y la producción de biomasa rica en proteínas. Este protocolo puede aplicarse en el procesamiento sostenible de yuca, la valorización de residuos agrícolas, la producción de piensos y sistemas biotecnológicos de bajo coste. Para empezar, etiqueta los frascos estériles con tapa ventilada de 500 mililitros con el tipo de sustrato como garri.

Marca la concentración adecuada del objetivo en el frasco. Etiqueta el matraz con la réplica de identificación y condición de esterilización planificada como autoclavada o no autoclavada. Coloca un báscula sobre la balanza analítica.

Después de presionar tare, pesa el garri para que coincida con el volumen final de trabajo. Añade asépticamente el garri pesado en un frasco estéril de 500 mililitros que contenga 300 mililitros de agua desionizada o destilada. Vuelve a poner la tapa ventilada en cada matraz.

Mezcla cada suspensión durante tres minutos hasta que la mezcla esté homogeneizada. Si se utiliza agitación magnética, coloque el matraz sobre una placa agitadora y ajuste la velocidad a 200G para formar un vórtice poco profundo sin salpicaduras. Deja que la suspensión se hidrate sin molestar durante 10 minutos a 25 grados Celsius.

Aprieta la tapa de ventilación justo antes de la fermentación y haz girar el matraz a mano cinco veces para homogeneizar suavemente la mezcla y volver a suspender el material sedimentado. Para preparar medios adicionales de productos de yuca, etiqueta los frascos y pesa el sustrato como se ha demostrado anteriormente para alcanzar 30 gramos por litro según el volumen de trabajo. Añade asépticamente el sustrato pesado en un matraz estéril que contenga 300 mililitros de agua desionizada o destilada.

Vuelve a poner la tapa ventilada en cada matraz. Hidrata y mezcla la suspensión como se ha demostrado antes. Confirma que los matrazes están equipados con un tapón ventilado estéril permeable al gas para permitir el intercambio de gases minimizando la contaminación ambiental.

Coloca los frascos en posición vertical a 25 grados Celsius en un área designada, alejada de la luz solar directa y del flujo de aire de alto tráfico, e incuba los frascos sin agitación durante un mínimo de 72 horas. Registra la fecha y hora de inicio de fermentación para cada matraz y condición. Confirma que cada matraz de 500 mililitros contiene no más de 300 mililitros de líquido tras la fermentación para evitar el ebullición durante la esterilización.

Una vez que la tapa ventilada esté aflojada hasta una posición de apretadura con los dedos, aplica cinta indicadora de autoclave en el frasco. Después de cargar los frascos en una bandeja segura para autoclave, coloca la bandeja en el autoclave y selecciona el ciclo líquido P13. Ajusta los parámetros de esterilización a 121 grados Celsius durante 30 minutos para la esterilización líquida.

Inicia el ciclo del autoclave. Una vez completado el ciclo, permite que la presión de la cámara del autoclave vuelva a la presión atmosférica y abre la puerta del autoclave lentamente. Usando guantes resistentes al calor, retira los frascos y déjalos enfriar a temperatura ambiente.

Guarda los frascos enfriados toda la noche a temperatura ambiente antes de la inoculación. Utiliza el medio fermentado de yuca directamente sin autoclave para preservar las comunidades microbianas nativas. Inocular el medio no autoclavado inmediatamente después del periodo de fermentación de 72 horas para minimizar la contaminación ambiental no deseada.

Mantener un manejo consistente entre réplicas utilizando el mismo tipo de matrazas ventiladas de 500 mililitros, el mismo volumen de trabajo y la misma duración de fermentación para todas las condiciones del sustrato. Inocular Euglena gracilis en un medio nutritivo fresco heterotrófico. Incubar los cultivos en completa oscuridad a 28 grados Celsius con agitación orbital continua a 120G hasta que los cultivos alcancen un crecimiento logarítmico medio.

Utilizando un microscopio óptico compuesto en modo campo claro, examina los cultivos con una magnificación total de 100x a 400x y confirma motilidad activa, morfología celular alargada y bajos niveles de insistencia. Excluye cultivos que presenten exceso de residuos celulares, morfología anormal o una insistencia elevada antes de los experimentos de adaptación. Tras homogeneizar suavemente los cultivos iniciadores apretando la tapa de ventilación, haz girar los frascos a mano durante 15 segundos para asegurar una distribución uniforme de las células sin inducir esfuerzos excesivos.

Utilizando un hemocitómetro de Neubauer, determina la densidad celular. Una vez mezclado el cultivo, haciendo girar el matraz durante 15 segundos, se pipete un mililitro de cultivo en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Limpia el hemocitometro y la cubierta con etanol al 70% y deja que el hemocitómetro y la cubierta se sequen al aire.

Pipetear 10 microlitros de cultivo sobre las dos rejillas del hemocitómetro y colocar el desliz de la tapa sobre la muestra húmeda. Utilizando microscopía de campo claro con un objetivo de 10x, céntrate en la cuadrícula y cuenta las celdas dentro de un conjunto definido de cuadrados en la cuadrícula grande aplicando las reglas estándar de límite. Repite el número de células en la segunda cámara y calcula la media de celdas por mililitro y la densidad celular.

Ajustar los volúmenes de inoculación para lograr un inóculo final del 5% en volumen en todos los medios experimentales. Prepara unóculos separados para cada condición de tratamiento para mantener densidades celulares iniciales consistentes entre los grupos experimentales. Añadir el inóculo preparado de E. gracilis a medios de yuca autoclavados y no autoclavados preparados a concentraciones finales de garri de 10, 20 y 30 gramos por litro.

Utilizar volúmenes de inoculación iguales en todas las condiciones de tratamiento para estandarizar la densidad celular inicial. Después de apretar la tapa ventilada, gira suavemente el matraz en un movimiento circular durante 15 segundos para distribuir las celdas. Incubar los cultivos en completa oscuridad a 25 grados Celsius para iniciar el crecimiento heterotrófico.

Minimizar la agitación del medio no autoclavado para preservar la estructura de la comunidad microbiana nativa y la estratificación del sustrato. Mezcla todos los cultivos una vez al día usando un suave giro manual durante 15 segundos para mantener el contacto entre las células de E. gracilis y el material de yuca suspendido. Utilizando una punta de pipeta estéril, cada 48 horas, recoge asépticamente muestras de un mililitro de cada cultivo.

Aprieta la tapa ventilada y agita suavemente el matraz de cultivo durante 15 segundos antes de la muestra para asegurar una distribución uniforme de las células y el material en suspensión. Tras transferir una alícuota de cultivo a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros, diluye la muestra con agua desionizada según sea necesario para mejorar la visualización de las células individuales. Prepara una lámina de microscopía de montaje húmedo pipeteando 10 microlitros de la muestra diluida sobre una lámina limpia y cubriendo la muestra con un engobe de cubierta.

Utilizando un microscopio óptico compuesto en modo campo claro, examina las muestras con una magnificación total de 100x a 400x y evalúa la motilidad celular, la morfología y la frecuencia de insistencia como indicadores del estado de adaptación. Cada siete días, transfiere asépticamente un 20% de volumen por volumen de cada cultivo a medios de yuca recién preparados con las mismas condiciones de concentración de garri y esterilización. Mantener volúmenes de transferencia consistentes entre pasajes y repetir el paso serial hasta que los cultivos muestren crecimiento constante, motilidad sostenida y baja frecuencia de insistencia en medios de yuca de 30 gramos por litro.

Tras la adaptación a alta concentración de yuca y el análisis comparativo de crecimiento, se utilizan tiras colorimétricas para evaluar los niveles de cianuro y observar el color revelado. Tras la centrifugación, se recolecta biomasa para análisis aguas abajo. En condiciones de cultivo completamente oscuro, los cultivos cultivados a 30 gramos por litro de garri mostraron un crecimiento integrado mayor que concentraciones más bajas.

Concentraciones más bajas de garri, de 10 a 20 gramos por litro, mostraron un crecimiento detectable pero reducido y más variable. Concentraciones más altas, de 40 a 50 gramos por litro, alcanzaron densidades celulares máximas elevadas, pero mostraron estabilización tardía y mayor variabilidad. Los ensayos de exclusión de azul de tripán indicaron que los cultivos mantenidos a 30 gramos por litro de garri mantuvieron alta viabilidad en los puntos de tiempo muestreados.

Las concentraciones más altas de garri mostraron reducciones transitorias en la viabilidad seguidas de una recuperación parcial con mayor variabilidad a lo largo del tiempo. Los resultados positivos incluyeron células redondeadas o semi-insistentes con motilidad reducida que permanecieron intactas a través de la subcultura repetida. Las culturas adaptadas de E. gracilis mostraron crecimiento reproducible en múltiples tipos de sustratos y mostraron una estabilización más temprana con un declive reducido en etapas avanzadas en comparación con las de tipo salvaje.

La implementación exitosa del protocolo produjo biomasa de E. gracilis con contenido medible de proteína cruda, cuantificado por análisis de laboratorio externo utilizando el método de combustión de Dumas. Los porcentajes de proteínas observados en cultivos adaptados fueron comparables a los medidos en cultivos de tipo salvaje con mayor producción total de proteínas correspondiente a un aumento de la acumulación de biomasa. Este protocolo permite a los investigadores estudiar el crecimiento de Euglena, la reducción de cianuros, la producción de biomasa y el potencial nutricional en diferentes entornos basados en yuca.

El desafío crítico de este protocolo es mantener una temperatura estable, condiciones de cultivo consistentes y una comunidad microbiana equilibrada para el crecimiento de Euglena. Estudios futuros pueden optimizar y escalar este protocolo, mejorar el rendimiento de proteínas y probar diferentes aplicaciones industriales utilizando diversos flujos de residuos de yuca a gran escala.