Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Nuestro laboratorio estudia el papel de las células asesinas naturales en la salud y la enfermedad, con el objetivo de aprovechar su potencial para mejorar los tratamientos contra los cánceres sólidos y hematológicos. Los ensayos existentes de citotoxicidad de células asesinas naturales carecen de estandarización entre plataformas y configuraciones. Este protocolo proporciona métodos reproducibles de citometría de flujo y de imagen en tiempo real con células vivas para una evaluación precisa de la citotoxicidad.

Para comenzar, prepare 10 mililitros de SYTOX Orange 2x diluyendo la solución stock de SYTOX Orange en medio de cultivo NK-92 en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Cuente las células diana utilizando un contador Luna después de mezclarlas con azul de tripano o emplee cualquier método validado de conteo celular basado en exclusión de colorante. Transfiera la cantidad necesaria de células diana a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros.

Centrifugar el tubo a 300G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. A continuación, re-suspender las células diana hasta una concentración final de 250.000 células por mililitro en medio 2X SYTOX Orange. Para preparar la célula efectora, evaluar la viabilidad y concentración de las células NK-92 y continuar solo si la viabilidad es mayor al 80%, ya que una viabilidad más baja podría afectar el rendimiento del ensayo.

Cuente y transfiera el número requerido de células NK-92 a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Tras la centrifugación, re-suspenda las células hasta una concentración final de 500.000 células por mililitro. Prepare diluciones de células efectoras añadiendo 240 microlitros de células efectoras a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo redondo para una proporción de dos a uno de efectoras a diana, y añada 120 microlitros de medio a los pocillos restantes.

Realice diluciones seriadas por duplicado desde una relación de dos a uno hasta una relación de 0,25 a uno entre efector y diana, mezclando completamente mediante pipeteo al menos cinco veces y cambiando las puntas entre transferencias. A continuación, para preparar el co-cultivo, obtenga la placa de 96 pocillos con fondo plano recubierta con polilisina. Inmediatamente antes de la transferencia, re-suspenda completamente las células diana y efectoras sin crear burbujas, luego agregue 100 microlitros de cada suspensión celular a los pocillos correspondientes.

Luego, agregue 200 microlitros de PBS a los pocillos periféricos no utilizados. Centrifugue la placa a 100G durante dos minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa en el sistema de imagenología de células vivas.

Adquiera imágenes cada hora durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Verifique la calidad de la imagen tras el primer escaneo y ajuste la configuración de adquisición de imágenes si es necesario. Ajuste la separación espectral para corregir el desbordamiento de SYTOX Orange hacia el canal verde.

Verifique que las células muertas positivas de color naranja no se identifiquen erróneamente como células positivas verdes. Para configurar el análisis por célula de células no adherentes, establezca el diámetro esperado del objeto en 15 micrómetros para que coincida con el diámetro celular aproximado. Establezca la sensibilidad del umbral y la sensibilidad de textura en cinco, y la sensibilidad del borde en 10 para facilitar la separación de los grupos celulares.

Establezca el rango del filtro de área de objeto aceptado entre 50 y 2.000 micrómetros cuadrados para excluir restos y objetos grandes. Establezca el valor máximo de excentricidad en 0,95 para excluir objetos no celulares. Obtenga células NK humanas primarias cultivadas durante 16 a 24 horas.

Transfiera 500,000 células diana a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Lave las células una vez con 10 mililitros de PBS. Centrifugue las células a 300G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, elimine el sobrenadante. Prepare una solución de trabajo de 0,5 micromolar de éster succinimidilo de carboxifluoresceína o CFSC en PBS diluyendo un microlitro de la solución stock de CFSE de cinco milimolar en 10 mililitros de PBS. Re-suspenda el sedimento obtenido a aproximadamente un millón de células por mililitro en la solución de CFSE.

Incube las células durante 15 minutos a 37 grados Celsius, envueltas en papel de aluminio para protegerlas de la luz. Luego, detenga la reacción añadiendo de cinco a diez volúmenes de medio de cultivo e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Después de centrifugar las células, re-suspenda el sedimento celular a 250.000 células por mililitro, de modo que 100 microlitros contengan 25.000 células.

Añada 100 microlitros por pocillo de células diana a los pocillos designados de una placa de 96 pocillos de fondo redondo utilizando una pipeta multicanal. Plaque cada condición por triplicado. A continuación, prepare 200 microlitros de solución de anticuerpo 4X en medio de cultivo de células NK para cada anticuerpo de prueba y su control de isotipo emparejado.

Transfiera las soluciones de anticuerpos a una placa de pocillos profundos. Añada 50 microlitros de solución de anticuerpo a cada pocillo que contenga las células diana y mezcle bien pipeteando arriba y abajo al menos cinco veces. Añada 50 microlitros de medio de cultivo de células NK por pocillo a los pocillos de control sin anticuerpo y mezcle bien mediante pipeteo.

Incube la placa durante 25 a 30 minutos bajo condiciones estándar de incubación. Cuente y obtenga 200.000 células NK y continúe solo si la viabilidad es mayor o igual al 75 %. Re-suspenda las células a 250.000 células por mililitro en 800 microlitros de cultivo de células NK humanas primarias. Añada 50 microlitros por pozo de células NK a los pozos correspondientes y mezcle bien pipeteando arriba y abajo al menos cinco veces.

A continuación, pipetee 50 microlitros por pocillo de medio de cultivo en los pocillos de control y mezcle bien. Inspeccione cuidadosamente la placa de 96 pocillos con fondo redondo para confirmar que todos los pocillos contengan 200 microlitros con niveles de menisco uniformes y sin burbujas. Centrifugue la placa durante dos minutos a 100G y luego incúbela durante 16 a 18 horas bajo condiciones estándar de incubación.

Centrifugar la placa durante cinco minutos a 300G y desechar el sobrenadante. Lavar todos los pocillos con 200 microlitros por pocillo de tampón para clasificación de células por citometría de flujo o tampón FACS. Preparar una mezcla maestra de anticuerpos de superficie en tampón FACS como se indica aquí.

Re-suspenda las células en 50 microlitros por pocillo de la mezcla maestra de anticuerpos y mezcle bien pipeteando arriba y abajo al menos cinco veces. Incube la placa durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, envuelta en papel de aluminio para protegerla de la luz. Añada 150 microlitros por pocillo de tampón FACS.

Tras la centrifugación, re-suspender las células en 100 microlitros por pocillo de DAPI cinco micromolar en tampón FACS. Proceder inmediatamente a la adquisición por citometría de flujo sin incubación previa a la adquisición. Realizar la citometría de flujo utilizando el instrumento Cytek Aurora y registrar los canales de fluorescencia para CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI y cualquier otro fluoróforo adicional.

Durante el cultivo conjunto, las células efectoras, las células diana vivas y las células muertas se visualizaron mediante microscopía en tiempo real de células vivas. Las células NK-92 con CAR2 y CAR3 exhibieron una cinética de lisis más rápida que las células NK-92 con CAR1, particularmente en los puntos de tiempo iniciales y con una relación igual de efector a diana. La lisis de las células diana aumentó con relaciones más altas de efector a diana, incluyendo las células NK-92 de control, que demostraron citotoxicidad natural.

Las células NK-92 CAR2 y CAR3 demostraron una mayor potencia a relaciones más bajas de efector a diana en puntos temporales posteriores. Aunque se observó una potencia mejorada a relaciones intermedias de efector a diana en puntos temporales más tempranos. Se definieron tres parámetros, KR50, KT50 e IKI-50, para cuantificar la potencia de las células CAR-NK-92, la cinética de lisis y el rendimiento citotóxico general a través de las poblaciones efectoras.

La adición de daratumumab por sí solo no redujo la supervivencia de las células diana, lo que confirma que el anticuerpo no tuvo ningún efecto directo sobre la viabilidad de las células diana en ausencia de células efectoras. La co-cultura con células NK por sí sola redujo la supervivencia de las células diana a aproximadamente el 70 %, lo que indica una citotoxicidad natural basal. La adición de daratumumab redujo aún más la supervivencia celular a aproximadamente el 37 %, lo que es consistente con una citotoxicidad mediada por anticuerpos potenciada.

En contraste, la condición de control de isotipo mostró aproximadamente un 62% de supervivencia, comparable con la condición de solo NK. La desgranulación de las células NK fue más baja en la co-cultivo de células NK y células diana sin anticuerpo, y más alta en la condición tratada con daratumumab, con aproximadamente un 31%, mientras que el control de isotipo mostró una desgranulación intermedia de aproximadamente un 19%. Este protocolo permite a los investigadores cuantificar la citotoxicidad natural de las células NK, evaluar la potencia de eliminación de tumores de diseños de CAR-NK y comparar la eficacia de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos monoclonales. Una consideración clave al realizar este protocolo es mantener un recuento preciso y consistente de células, así como una pipetación y siembra exactas de las células NK y células diana, para garantizar resultados confiables e interpretables.

Estudios futuros pueden aprovechar estos protocolos para explorar el escape inmunitario de las células NK, comparar la susceptibilidad tumoral y evaluar nuevas inmunoterapias basadas en células NK en diferentes tipos de cáncer.