La construcción y la implantación de un Sistema de microinfusión para la entrega sostenida de agentes neuroactivos.

Hola, mi nombre es Miles Cunningham. Junto con Ryan O'Connor y Sydney Wong, demostraremos la construcción de un sistema de microinfusión para la administración continua de agentes neuroactivos. Este trabajo se realizó en el laboratorio de neuroreconstrucción del Hospital McLean, de la Escuela Médica de Harvard.

Queremos agradecer a la Fundación Sydney rbe y a Narsad por su generoso apoyo. Hemos descubierto que los agentes neuroactivos pueden administrarse de manera confiable a sitios cerebrales discretos mediante una microcánula de vidrio de borosilicato estirado con un diámetro de punta cinco a diez veces más pequeño que el de las cánulas de administración convencionales. En esta diapositiva, mostramos una cánula de infusión de acero inoxidable comúnmente utilizada junto a una microcánula que hemos fabricado en este laboratorio.

Esta reducción en el tamaño de la cánula de administración se traduce en una disminución drástica del trauma en la región cerebral que se estudia. Muchos métodos convencionales, de hecho, producen una lesión en o dentro del área de interés, lo que pone en duda la validez de cualquier resultado. Aquí, en el panel A, puede observarse la magnitud de la alteración en la zona local causada por una cánula de 0,32 milímetros en comparación con una cánula de 50 micrones en el panel B. Estas microfotografías de baja potencia corresponden a preparaciones húmedas de secciones de Vibram sin tinción.

Estas mismas secciones se tiñeron luego con H y E e se imaged a mayor aumento. Para ilustrar aún más la reducción del daño tisular con la cánula micro, los componentes del sistema de microinfusión son una bomba mini Osmo zet con su modulador de flujo de acero inoxidable en la que se ha eliminado la brida. De dos a tres centímetros de tubo de polietileno, una cánula micro de silicato BOA hecha a medida y un alambre guía de calibre 28, y este es el sistema de microinfusión ensamblado listo para la implantación.

Se utiliza aquí un polar vertical estándar para pipetas con el fin de crear microcánulas con las especificaciones deseadas. Los polares horizontales también son adecuados. El tubo de borosilicato se posiciona y fija ajustando la temperatura del elemento calefactor y la tensión del polar.

Puede reproducir de manera confiable microcánulas con diámetros específicos y largos tallos cónicos. El tubo de sílice Bora se calienta y se aplica una presión suave para reducir la cantidad deseada de curvatura en el tubo. Esta curvatura se realiza a una distancia desde la punta de la microcánula que es adecuada para la profundidad del objetivo cerebral de interés y que permite un espacio libre por encima del cráneo.

La longitud final de este tubo distal de la microcánula, el doblez es de aproximadamente nueve a 10 milímetros. Al parecer insatisfecho con su resultado, Ryan vuelve a insertar la microcánula para realizar un ajuste fino y perfeccionar el ángulo del doblez.

Es mucho mejor utilizando un lápiz de diamante. Sydney demuestra un método para cortar el tubo de borosilicato aproximadamente cinco milímetros proximal al doblez, sosteniendo firmemente el tubo sobre una superficie dura con la porción distal de la microcánula libre para colgar por el borde. Ella realiza un rayado circunferencial del tubo.

Luego, aplicando una presión suave, rompe limpiamente el tubo en la interfaz marcada. La fina punta transparente de la cánula puede colorearse entonces con tinta permanente para facilitar su visualización. Durante la cirugía con aumento, la punta de la cánula microquirúrgica se corta con tijeras de disección microquirúrgica hasta el diámetro deseado.

El diámetro de la punta puede confirmarse con un ocular o un microscopio. Los alambres de alineación radical se preparan a partir de alambre de acero inoxidable de calibre 28 que se corta en longitudes de aproximadamente tres centímetros. Luego se utilizan pinzas para crear un pequeño gancho en el extremo de cada alambre, con un diámetro de alrededor de dos milímetros.

Los alambres de alineación se colocan en una placa de Petri junto con trozos de tubo de polietileno de dos a tres centímetros de longitud en las microcánulas. El sistema de microinfusión puede construirse con instrumentos comunes en la mayoría de los laboratorios. Pinzas microquirúrgicas, pinzas convencionales, tijeras quirúrgicas y hemostatos se colocan en un campo quirúrgico para su esterilización.

Los instrumentos, los componentes del sistema de microinfusión, así como varias hojas de papel de aluminio se esterilizan utilizando un autoclave estándar. El modulador de flujo se retira cuidadosamente de su envase y se coloca en una placa de Petri estéril. Se sujeta firmemente con pinzas hemostáticas y la brida de plástico se retira del tubo del modulador de acero inoxidable con tijeras.

La bomba osmótica miniatura también se retira de su empaque y se coloca en la placa de Petri estéril. El tubo de acero inoxidable se inserta en el tubo de polietileno aproximadamente de dos a tres milímetros, y ambos se sellan juntos utilizando epoxi activado por luz. Utilizamos Lummi bond de mi laboratorio neural para trabajos delicados; llenamos una jeringa de un CC con Lummi bond y usamos una aguja de calibre 27 como aplicador. Bajo luz intensa, Lumon se cura en solo unos segundos.

La bomba osmótica miniatura se llena sosteniéndola en posición vertical e inyectando cuidadosamente el líquido con la aguja de llenado proporcionada por el fabricante. Recomendamos observar el volumen de líquido inyectado en la bomba o pesar la bomba antes y después del llenado para asegurar que esté completamente llena y no presente defectos. Tenga en cuenta que no recomendamos reutilizar las bombas.

El modulador completo, con su tubo de polietileno acoplado, se inserta luego dentro de la bomba osmótica miniatura. El líquido dentro de la bomba será forzado hacia el tubo de polietileno a medida que se inserte el modulador de espuma. Se anota la distancia inicial del tubo de polietileno lleno de líquido y se debe observar que aumenta después de que la bomba haya sido activada mediante incubación con solución salina estéril a 39 grados Celsius tras 12 horas de incubación.

La bomba osmótica miniactivada se sumerge en solución salina estéril, lo que proporciona un entorno libre de aire para los pasos finales en la construcción del sistema de microinfusión. Se utiliza una jeringa equipada con un tubo plástico de pequeño calibre y llenada con la misma solución contenida en la bomba para desplazar el aire de la porción vacía del tubo de polietileno. Tenga en cuenta que el aire dentro de la cánula micro debe ser desplazado.

De manera similar, es posible que sea necesario dilatar ligeramente el extremo distal del tubo de polietileno con pinzas microquirúrgicas, y luego se inserta el extremo proximal de la microcánula. Todo el sistema ya está libre de aire o espacio muerto, puede retirarse del baño salino y secarse con material estéril. A continuación, se aplica luma bond para fijar la microcánula al tubo de polietileno. Para reducir aproximadamente a la mitad el caudal de la bomba osmótica miniatura, se vierte parafina estéril caliente en una pequeña placa de Petri y se sumerge brevemente la mitad proximal de la bomba osmótica miniatura.

Se absorbe el exceso de parafina y el sistema de microinfusión se vuelve a colocar en solución salina estéril, donde se mantiene hasta la cirugía. Justo antes del implante quirúrgico, el alambre guía se fija en la curva de la microcánula.

El eje longitudinal del alambre guía se alinea con la porción de la microcánula que entrará en el tejido cerebral y se fija con lúmon. En esa posición, el sistema de microinfusión puede colocarse luego en un manipulador de instrumento estereotáxico.

El alambre guía se fija con una abrazadera del brazo manipulador, y la bomba se sujeta desde arriba con un lazo de sutura estéril. Esto soportará su peso y permitirá alinear perfectamente la microcánula perpendicularmente a la superficie del cráneo doblando cuidadosamente el alambre guía con pinzas; luego, el sistema de microinfusión puede implantarse utilizando un procedimiento estereotáxico estándar. El tubo de boel se fija a la superficie del cráneo con adhesivo.

Utilizamos el mat Jaron para moldear un pedestal de perfil bajo. El exceso de alambre guía que sobresale por encima de la preparación se corta entonces al ras con la superficie del pedestal. Usando una rueda de corte acoplada a una broca de alta velocidad, la mini bomba osmótica puede colocarse entonces por vía subcutánea entre la escápula del animal.

El presente método ofrece varias ventajas sobre las técnicas tradicionales. Puede construirse personalizado para adaptarse a la especie y edad del animal experimental. El tubo de sílice puede moldearse para ajustarse a la superficie del cráneo del animal.

Por lo tanto, al permitir una fijación segura de perfil bajo y evitar la necesidad de un pedestal craneal grande, la herida quirúrgica puede cerrarse fácilmente sobre el pedestal de microinfusión aerodinámico, reduciendo así el riesgo de infección y el malestar para el animal, además de requerir menos área superficial para fijar el sistema al cráneo. Por consiguiente, pueden realizarse procedimientos adicionales o posteriores sin interferencias provocadas por un pedestal más grande. Lo más importante, sin embargo, es que este método reduce la invasividad y el trauma en el entorno local del sitio de infusión, minimizando así el efecto del observador.

Es decir, los cambios que la observación activa provocará en el fenómeno que se observa.