Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Las mitocondrias tienen numerosas funciones en la fisiología celular, desde el metabolismo y la producción de energía hasta la muerte celular programada y la síntesis de hormonas esteroides. A pesar de la importancia de las mitocondrias tanto en funciones celulares fundamentales como en enfermedades, se conoce muy poco sobre la función de las mitocondrias en las células madre embrionarias humanas y sus descendientes diferenciados. En este video, le mostraremos cómo se pueden analizar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de células madre humanas mediante ensayos de actividad en gel.

Hola, soy Ivan OV del laboratorio de Michael Tetel en el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar la función de los complejos respiratorios mitocondriales en células madre embrionarias humanas. Este ensayo de actividad en gel implica el aislamiento de un sobrenadante mitocondrial crudo a partir de células madre embrionarias humanas, la separación de los complejos mitocondriales del sistema de fosforilación oxidativa mediante electroforesis en gel nativo claro de poliacrilamida de alta resolución y, posteriormente, el análisis de actividad en gel.

Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento es aislar mitocondrias de células madre embrionarias humanas. Para este ensayo, utilizaremos células madre embrionarias humanas que se han cultivado en una placa recubierta con matrigel en condiciones libres de células alimentadoras.

Para recolectar mitocondrias a partir de nuestras células madre humanas, comenzamos lavándolas con PDS 1X tibio a pH 7,4 y luego tratamos las células con tripsina durante cinco minutos. Puede utilizarse un mililitro de tripsina 1X por pocillo en una placa de seis pocillos. Después de cinco minutos, se puede detener la reacción añadiendo un volumen igual de inhibidor fresco de tripsina (un miligramo por mililitro) en PBS 1X y recolectar las células.

Las células recolectadas se centrifugan luego a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda las células del sedimento en 0,8 a 1,7 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias frío con hielo, que contenga una mezcla recién preparada de inhibidor de proteasas al 1 x. La cantidad de tampón que utilice depende del tamaño del sedimento celular obtenido. Una vez que el sedimento haya sido resuspendido, incúbelo en hielo durante aproximadamente 10 minutos.

Después de la incubación, rompemos las células con un homogenizador, lo que podría tomar aproximadamente de 40 a 50 movimientos. Podemos verificar la completa homogenización teñiendo una alícuota de las células DOD con azul de trian y observándolas mediante un microscopio óptico. Debería verse algo así.

Este es el primer disparo tras 50 golpes con un downs. Este es el segundo disparo tras 80 golpes con un downs. Una vez que las células estén homogenizadas, centrifúgelas a 20.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados C. Esto nos dará un precipitado mitocondrial crudo, que también contendrá núcleos y fragmentos celulares más grandes.

Antes de recolectar el pellet, debemos pesar el tubo de recolección para estimar el peso subsiguiente del pellet, verter y descartar el sobrenadante, y luego pesar el pellet crudo de mitocondrias precipitado. Restando el peso del tubo en este punto, se puede proceder a solubilizar el pellet, lo cual se mostrará en el siguiente paso. Para solubilizar el pellet mitocondrial crudo, comenzamos manteniendo el pellet en hielo y aplicando vortex con 35 microlitros de tampón de solubilización frío con hielo.

Por cada 20 miligramos de peleto, contamos con información detallada sobre los compuestos del tampón, que se menciona en el protocolo escrito adjunto. Tras la agitación con vórtex y la adición del tampón de solubilización, y antes de añadir digitonina, transferimos el peleto resuspendido a un tubo adecuado para centrifugación a alta velocidad, y luego añadimos 20 microlitros de digitonina al 10% peso por volumen por cada 20 miligramos de peso de peleto, y mezclamos agitando ligeramente el tubo. Después de mezclar completamente, incubamos el peleto mitocondrial durante cinco a 10 minutos en hielo. Doil beta D multisido o DDM o Triton X-100 pueden sustituir a la digitonina para solubilizar las proteínas.

La elección del detergente y su cantidad pueden afectar la formación de supercomplejos o formas multiméricas de los complejos mitocondriales tras la incubación en hielo. Y una vez que el precipitado haya sido solubilizado, lo centrifugaremos a cien mil veces G durante 15 minutos a cuatro grados C, y luego recogeremos el sobrenadante claro. Ahora estamos listos para preparar el sobrenadante y correrlo en nuestro gel en gradiente para la electroforesis nativa en gel con gradiente de mitocondrias.

Recomendamos el uso de un gel de gradiente de acrilamida del cinco al 13 % con un gel de apilamiento del 3,5 %. Para preparar el gel, utilizaremos una mezcla de acrilamida-bisacrilamida según se describe en el protocolo escrito. La solución de acrilamida-bisacrilamida se prepara por adelantado y se almacena a cuatro grados Celsius en un lugar oscuro.

El acrilamida y la bis-acrilamida son sustancias químicas tóxicas tanto en forma de polvo como en forma líquida, por lo que se debe prestar especial atención al manipularlas. Combinamos la solución de acrilamida-bis-acrilamida con una alícuota de tampón para gel tres veces, compuesto por 1,5 molar de ácido hexanóico seis amino y 75 milimolar de ole a pH 7,0. La cantidad de solución de acrilamida-bis-acrilamida que agregamos al tampón dependerá del porcentaje de gel que estemos preparando para hacer el gel en gradiente.

Prepararemos una mezcla al 4 % y una mezcla al 13 %, y el gel de apilamiento será una mezcla al 3,5 %. No olvide añadir glicerol a la mezcla al 13 %. Cuando las tres mezclas estén listas, agregamos una cantidad adecuada de sulfato de amonio persulfato y TEMED a las mezclas y vertemos las mezclas en una cámara de moldeo formadora de gradientes.

La parte izquierda de la cámara contiene la mezcla al 5%. La parte derecha de la cámara contiene la mezcla al 13% con una pequeña barra magnética de agitación. Comenzamos a verter el gel abriendo la parte derecha de la cámara.

Luego, inmediatamente abrimos la parte izquierda de la cámara y dejamos que la solución al 5 % se mezcle con una solución al 13 % para formar el gradiente. Añadimos una pequeña cantidad de isopropanol sobre la parte superior del gel para formar un borde nítido y recto en el gel tras la polimerización. Aproximadamente una hora después, cuando se completa la polimerización del gel en gradiente, eliminamos el isopropanol y vertemos el gel de apilamiento al 3,5 % en el aparato e insertamos un peine para geles.

Ensamblaremos y correremos los geles en una cámara fría de aproximadamente cuatro a siete grados Celsius. Para correr este gel, utilizaremos dos buffers diferentes. En la cámara del ánodo, usaremos un buffer que contenga ácido clorhídrico 25 milimolar pH 7,0.

El tampón catódico contendrá 50 milimolar de tric, 7,5 milimolar de ácido ole clorhídrico, 0,02% peso por volumen de doil beta D multisido o DDM y 0,05% peso por volumen de deoxi coato pH 7,0. Con el fin de preparar el sobrenadante que se va a correr en el gel que acabamos de verter, se añade tampón de carga para obtener una concentración final de 5% peso por volumen de glicerol y 0,01% peso por volumen de Ponto S. Normalmente, añadimos una solución stock 10x que contiene glicerol y Poncho S directamente a los sobrenadantes.

Ahora estamos listos para cargar la muestra en el gel. Cargaremos los pocillos del gel con un volumen que contenga entre 20 y 40 miligramos de proteína mitocondrial cruda por carril. Inmediatamente después de la carga, se realiza la electroforesis a 100 voltios.

Una vez que la muestra ha entrado en el gel de apilamiento, el voltaje puede aumentarse a 500 voltios con la corriente limitada a 15 miliamperios. Aunque normalmente corremos el gel durante toda la noche a 70-100 voltios, detenemos la electroforesis cuando una línea nítida del colorante rojo de zos se acerca al frente del gel. Ahora que se ha corrido el gel, podemos analizar la actividad de los diferentes complejos proteicos directamente en el gel.

El tiempo de incubación para cada ensayo depende de la eficiencia de solubilización de las proteínas y de la cantidad de material cargado por pocillo. Los complejos uno, cuatro y cinco suelen producir señales más intensas que los complejos dos y tres. Por esta razón, el tiempo de tinción para los complejos dos y tres debe ser más largo.

Para probar la actividad del complejo, necesitaremos usar tampones específicos para cada complejo. Puede encontrar los ingredientes de los tampones individuales en el protocolo escrito. Ahora cortaremos las bandas individuales del gel para realizar los ensayos de actividad en gel por separado.

Para todos los complejos, incubar el trozo de gel en sus respectivos tampones durante varias horas a temperatura ambiente, excepto para el complejo cinco. Después de la incubación, fijar el gel en metanol al 50 % y ácido acético al 10 % durante 15 a 45 minutos. El gel fijado se conserva en ácido acético al 10 %.

Aquí puede observarse cómo aparece la tinción del complejo I. Hay una banda de color púrpura intenso en el trozo de gel que corresponde al complejo I. Los geles claros permiten realizar densitometría a partir de las actividades de los complejos mitocondriales y realizar análisis comparativos.

Después de la citometría densa, generalmente secamos las rebanadas de gel para almacenamiento a largo plazo y/o para escanearlas con el fin de obtener una imagen de alta calidad. Dos complejos tiñen del mismo color púrpura: el complejo tres y el complejo cuatro. Ambos producen una banda teñida de color anaranjado o amarillento. A continuación se muestran ejemplos de las actividades de tinción de los complejos dos, tres y cuatro.

Acabamos de mostrarle cómo analizar la actividad de los complejos de exudación mitocondrial, que se extrajeron de células madre embrionarias humanas y se separaron mediante electroforesis en geles nativos de alta resolución. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.