Aislamiento de neutrófilos Protocolo
23 de julio de 2008
Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.
Protocolo de aislamiento de neutrófilos. Este procedimiento extraerá glóbulos blancos de una muestra de sangre completa utilizando equipo de centrífuga y viales. Vortex, jeringa con aguja y filtro de jeringa.
Milli pour marca MX gv 0,22 micrómetros de materiales. La separación de neutrófilos mediante solución salina Hank requiere dos tipos de soluciones HBSS. HBSS con cloruro de calcio se utilizará para preparar una solución con albúmina sérica humana.
Se utilizará HBSS sin cloruro de calcio para suspender y lavar los neutrófilos. Tenga especial cuidado en usar la solución de HBSS adecuada en este procedimiento. El albúmina sérica humana o HSA es una proteína del plasma sanguíneo que mantiene el pH y la presión osmótica.
No utilice tampón de lisis de glóbulos rojos con amalgama de suero bovino. Este producto es fabricado por Roche Diagnostics, Medio de Aislamiento de Neutrófilos NIM Cedar Line Labs, Medio de Separación Lymph Light Poly, protegido de la luz y conservado en refrigerador para obtener mejores resultados. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente en el momento de su uso.
Saque los reactivos del refrigerador una hora antes del experimento. Prepare la solución de H-B-S-S-H-S-A para la separación de neutrófilos. Pipetee HBSS con cloruro de calcio en un vial.
Aspire la HSA hacia la jeringa. Evite atrapar burbujas de aire. Retire la aguja de la jeringa y sustitúyala por el filtro.
Inyecte HSA a través de un filtro en un vial de HBSS y vortexee para mezclar cuando tenga los demás materiales preparados y a temperatura ambiente; obtenga aproximadamente 15 mililitros de sangre completa. Esto producirá entre 10 y 15 mililitros de 10 a la octava de neutrófilos. El donante no debe haber consumido alcohol ni medicamentos de venta libre durante las 24 horas previas a la donación de la muestra de sangre.
Estos pueden interrumpir el proceso de separación. La sangre completa puede anticoagularse con citrato de EDTA o heparina agregando nueve partes de sangre a una parte de citrato sódico K3 EDTA o heparina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes pasos se describirán en este procedimiento.
Separar y eliminar el plasma y los monocitos. Separar y obtener una capa de neutrófilos lisando los glóbulos rojos para obtener neutrófilos en suspensión libre mediante la primera separación. Obtener los neutrófilos en la capa de NIM.
Recolecte cinco mililitros de medio de aislamiento en un tubo de centrífuga. Colocar el medio de aislamiento más abajo en el tubo permite que actúe como un filtro, ya que la centrífuga forzará la sangre a través de él cuidadosamente. Añada cuidadosamente cinco mililitros de sangre sobre el NIM para obtener una separación limpia.
Tenga mucho cuidado para evitar mezclar las soluciones. Realice este paso lentamente y con precaución, manteniendo la punta de la pipeta cerca de la superficie del medio de resolución para prevenir la mezcla. La solución a 500 RCF durante 35 minutos.
A 20-25 grados Celsius, la sangre debe separarse en seis bandas distintas. Las seis bandas son plasma, monocitos, medio de aislamiento, neutrófilos, más medio de aislamiento y el sedimento de glóbulos rojos en la parte inferior. Si estas seis bandas no son claras y definidas, el proceso de separación no fue limpio y debería repetirse.
Las causas comunes de una mala separación incluyen el uso de un medio de aislamiento procedente de un donante que haya consumido alcohol en las últimas 72 horas o que haya ingerido otros medicamentos como Tylenol o aspirina. Retire con cuidado y deseche el plasma, los monocitos y el medio de aislamiento. Coloque estas capas en un tubo hermético y deseche; luego, aspire cuidadosamente con una pipeta la capa de neutrófilos y todo el medio de aislamiento situado debajo de los neutrófilos, y transfiera esta mezcla a un tubo limpio de centrífuga para recuperar el mayor número posible de neutrófilos.
A menudo es más fácil incluir también algo del medio de aislamiento de la capa inferior. No perturbe el pallet en la parte inferior. Segunda declaración, refinar la capa de neutrófilos.
Diluya la solución de neutrófilos a 10 mililitros con HBSS sin calcio. Invierta el tubo varias veces para suspender las células y centrifugue. La solución de neutrófilos.
350 RCF durante 10 minutos. A 20-25 grados Celsius, debería observarse un sedimento rojo en el fondo del tubo que contiene neutrófilos y glóbulos rojos residuales. Retire el sobrenadante con la pipeta.
Tenga cuidado de no perturbar el precipitado en el fondo. Licuando los glóbulos rojos.
Las células rojas en la muestra deben destruirse ahora mediante lisis. Para lisar las células rojas residuales, agregue dos mililitros de tampón de lisis de células rojas al tubo para resuspender. Suspenda el precipitado y vortexee el vial a una configuración de tres a cuatro.
Evite aumentar la velocidad del vórtex por encima de cuatro, ya que esto podría provocar la activación de los neutrófilos. Puede ser necesario agitar en vórtex durante varios segundos o aplicar pulsos breves para disolver el precipitado. Centrifugue la solución de lisis a 250 RCF durante cinco minutos.
Utilice la opción de arranque suave para minimizar el daño a la muestra. Retire el sobrenadante con pipeta. Repita el proceso de lisis.
Si es necesario, para liberar la suspensión de neutrófilos, agregue 500 microlitros de HBSS sin calcio a cada tubo. Vortexee el precipitado en una configuración de tres a cuatro, diluya a 10 mililitros con HBSS sin calcio y centrifugue los neutrófilos a 250 RCF durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y deseche.
Re suspender el sedimento en 250 microlitros de solución de HBSS con HSA, dos veces 10 a la seis. Se recogen típicamente neutrófilos por mililitro.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para aislar neutrófilos humanos a partir de sangre total utilizando una técnica estándar de separación por gradiente de densidad. Los neutrófilos desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria inflamatoria, y comprender su aislamiento es fundamental para investigaciones posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Neurociencia
Antecedentes
- Los neutrófilos son uno de los primeros en responder en las reacciones inflamatorias.
- Sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro.
- Las técnicas de aislamiento son esenciales para estudiar el comportamiento y las funciones de los neutrófilos.
- Los métodos estandarizados mejoran la reproducibilidad en la investigación.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para aislar neutrófilos a partir de sangre humana.
- Facilitar investigaciones adicionales sobre las funciones de los neutrófilos en la inflamación.
- Proporcionar un protocolo que pueda adoptarse fácilmente en laboratorios.
Métodos Utilizados
- Método de separación por gradiente de densidad.
- Uso de medios de separación disponibles comercialmente.
- El equipo incluye centrífuga y viales.
- Preparación de soluciones utilizando HBSS con cloruro de calcio y albúmina sérica humana.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de neutrófilos a partir de muestras de sangre completa.
- Demuestra la eficacia del método de separación.
- Proporciona un protocolo claro para investigadores.
- Aplicaciones potenciales en el estudio del comportamiento de los neutrófilos en diversas condiciones.
Conclusiones
- El método presentado es efectivo para el aislamiento de neutrófilos.
- Este protocolo puede mejorar la investigación sobre las respuestas inmunitarias.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica de aislamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento confiable de neutrófilos es fundamental para la investigación inmunológica y de inflamación en etapas iniciales, ya que permite estudios funcionales precisos y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos. Las preparaciones de neutrófilos con alta pureza y viabilidad favorecen una validación robusta de objetivos y el desarrollo de ensayos cuantitativos, impactando directamente en la confianza predictiva en puntos clave de inflexión del portafolio. Los protocolos estandarizados de aislamiento facilitan la reproducibilidad y la integración de datos entre equipos multidisciplinarios de descubrimiento y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el estudio de vías específicas de neutrófilos y mecanismos inmunitarios relacionados con la inflamación y la oncología.
- Apoya la validación funcional de dianas al proporcionar poblaciones puras y viables de neutrófilos para ensayos posteriores.
- Reduce la ambigüedad biológica, fortaleciendo la confianza predictiva en las pruebas de hipótesis en etapas iniciales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona muestras estandarizadas de neutrófilos con alta viabilidad para ensayos in vitro reproducibles.
- Facilita la medición cuantitativa de funciones de los neutrófilos, como la fagocitosis y la producción de citoquinas.
- Permite la escalabilidad de los ensayos y la reutilización de plataformas para la selección de compuestos y estudios mecanicistas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Proporciona material celular relevante para la enfermedad, útil para modelar respuestas inflamatorias en sistemas preclínicos.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la función y viabilidad celular.
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir lecturas funcionales en células inmunitarias humanas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de aislamiento de neutrófilos mediante gradiente de densidad se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y el desarrollo de ensayos, apoyando flujos de trabajo desde la validación de dianas hasta la investigación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona neutrófilos puros para estudios funcionales basados en hipótesis y análisis de vías.
- Selección: Ofrece entradas cuantitativas reproducibles para ensayos celulares basados en células, útiles en la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición de viabilidad celular, pureza y resultados funcionales para análisis comparativos.
- Investigación Traslacional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos mediante el uso de células inmunitarias humanas primarias.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo estandarizado adaptable a múltiples programas de investigación y áreas de enfermedades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la incertidumbre mecanicista en los estudios de células inmunitarias.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, la estandarización y la escalabilidad de los ensayos basados en neutrófilos.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir datos iniciales robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en inflamación e inmunología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en separación por gradiente de densidad y manejo de células.
- Necesita acceso a equipos de centrifugación, reactivos estériles y medios de separación validados.
- Exige estricto cumplimiento de los controles de tiempo y temperatura para preservar la viabilidad celular.
- Requiere estandarización entre equipos para obtener resultados reproducibles en diferentes estudios.
- Limitado por la variabilidad entre donantes y la corta vida útil de los neutrófilos, lo que exige un uso rápido en pasos posteriores.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
