Trypsinizing Siembra y células de mamífero

La tecnología de cultivo de tejidos ha encontrado amplia aplicación en el campo de la biología celular. Sin embargo, las células cultivadas requieren mantenimiento regular para mantenerse sanas. Cuando las células alcanzan la confluencia, deben ser subcultivadas o pasadas.

El incumplimiento de esto provoca un crecimiento reducido y, eventualmente, la muerte celular. En este video, demostramos cómo mantener células en cultivo tisular, tanto para líneas celulares adherentes como en suspensión. Hola, soy Ricky, aquí en el Laboratorio del Dr. LAN en la Red de Laboratorios de Patología Molecular en el este de Tennessee.

Hoy quiero mostrarle dos técnicas para recoger células en suspensión y células adherentes. Para pasar una placa de células, comenzaremos con un cultivo primario crecido hasta confluencia en una placa de Petri de 60 milímetros o en un frasco de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados que contenga cinco mililitros de medio de cultivo de tejidos.

Comenzamos retirando todo el medio de la cultura primaria con la pipeta estéril. Luego lavamos la monocapa de células adheridas una o dos veces con un pequeño volumen de HBSS a 37 grados Celsius sin calcio ni magnesio. Para eliminar cualquier suero bovino fetal residual que pueda inhibir la acción de la enzima tripsina que se agregará en el siguiente paso.

A continuación, agregue suficiente solución tibia de tripsina-EDTA al cultivo para cubrir la capa de células adherentes. Luego, coloque la placa sobre una bandeja calefactora a 37 grados Celsius durante uno o dos minutos. Tras la incubación, golpee suavemente la base de la placa sobre una superficie plana para desprender las células.

Revise el cultivo con un microscopio invertido para asegurarse de que las células estén redondeadas, lo que indica que se han desprendido de la superficie. Si las células no se han desprendido suficientemente, regrese la placa a la bandeja calefactora durante un minuto o dos adicionales. Después de observar mediante el microscopio, enjuague el recipiente con medio completo y pipetee la suspensión hacia un tubo cónico de 15 ml que contenga 2 ml de medio completo.

Centrifugar las células para formar un precipitado y resuspender el precipitado en medio completo. A continuación, añadir un volumen igual de suspensión celular a cada una de las placas nuevas que han sido etiquetadas adecuadamente. Alternativamente, las células pueden contarse utilizando un hemocitómetro y diluirse hasta la densidad deseada para añadir un número específico de células a cada placa.

Asegúrese de etiquetar cada placa con la fecha del subcultivo y el número de pase. Después de agregar la suspensión celular, coloque un mililitro de medio fresco en cada nuevo cultivo. Incube ahora las placas en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% de CO₂.

Después de incubar las células durante la noche, agregue medio fresco a las placas y colóquelas nuevamente a 37 grados. Una vez que la placa haya alcanzado la confluencia, puede realizar un nuevo paso de cultivo repitiendo este procedimiento y continuar con los pasajes según sea necesario. Ahora le mostraremos cómo realizar el paso de células en cultivo de suspensión.

El envasado de células en cultivo en suspensión es más sencillo que el de células adherentes. Antes de envasar cultivos en suspensión, las células deben mantenerse alimentándolas cada dos o tres días hasta que alcancen la confluencia, momento en el que las células se agrupan en la suspensión y el medio aparece turbio. Cuando se agita el matraz.

Para hacer esto, retire el matraz con células en suspensión del incubador, teniendo cuidado de no perturbar las células que se han sedimentado en el fondo del matraz. De forma aséptica, retire y deseche aproximadamente un tercio del medio del matraz y reemplácelo con un volumen igual de medio precalentado a 37 grados Celsius. Después de cambiar el medio, agite suavemente el matraz y devuélvalo al incubador, que se encuentra a 37 grados Celsius y 5 %CO₂.

Si hay menos de 15 ml, incubar el matraz con medio en posición horizontal para mejorar el contacto entre las células y el medio. De lo contrario, el matraz puede incubarse en posición vertical en los días en que no se alimenten los cultivos. Revísense agitando suavemente las placas para resuspender las células.

Asegúrese de observar cualquier cambio de color en el medio que indique un buen crecimiento metabólico. Una vez que las culturas sean confluentes, lo que debería ser alrededor de 2,5 millones de células por mil, puede realizar el paso de cultivo. Una vez más, le hemos mostrado cómo realizar el paso de cultivo de células cultivadas tanto para cultivos adherentes como en suspensión.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con todos sus experimentos.