Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

La preparación de células dendríticas a partir de médula ósea proporciona una excelente fuente de células presentadoras de antígenos que pueden utilizarse para experimentos in vitro o in vivo en la imagenología de dos fotones del sistema inmunitario. La introducción de células presentadoras de antígenos permite el estudio de interacciones específicas entre células en el contexto del ganglio linfático vivo. Aquí demostramos el aislamiento estéril de la médula ósea y las técnicas de cultivo para la producción de células dendríticas maduras.

Además, seguimos el desarrollo de las células dendríticas desde el día uno hasta el día 11. Este desarrollo se muestra mediante imágenes fijas y videos del incubador realizados utilizando la tecnología Incus Site de Scent Technologies. Finalmente, mostramos células dendríticas derivadas de médula ósea presentando antígeno de cove a células T OT dos en el ganglio linfático espejo.

Hola, soy Melanie Matthew en el laboratorio de Micah Halen en la Universidad de California cercana. ¿Alguna vez te has preguntado qué ocurre en el interior durante el prober mientras tus células están creciendo? Hoy?

Como parte de nuestro protocolo, vamos a mostrarle cómo utilizar algunos instrumentos en el sitio. El sitio en línea le permite rastrear el crecimiento de cultivos celulares en su incubadora. En este protocolo, vamos a mostrarle cómo aislar y preparar células derivadas de médula ósea y células del grupo a partir de ratón.

Así que lo primero que voy a mostrarle cómo hacer es extraer los huesos del fémur y aislar la médula ósea. Primero sujete al animal. A continuación, humedezca al animal con etanol al 70 %. Realice la primera incisión a lo largo de la línea media del animal.

Luego corte por dentro de la pata tal como le estoy mostrando aquí. Para exponer el tejido muscular por encima del fémur, debería poder separar el músculo y agarrar el gran hueso del fémur con las pinzas de disección. Mientras sostiene el hueso con las pinzas de disección, descienda por el hueso y realice el primer corte justo debajo de la articulación.

Luego mueva las tijeras a lo largo de la longitud del fémur y corte lo más cerca posible del cuerpo. Esto puede provocar una pequeña cantidad de sangre, especialmente si se corta la arteria femoral. Al retirar el fémur, es extremadamente importante que el hueso se mantenga intacto.

Como puede observarse aquí, los extremos del hueso no han sido cortados ni alterados. Una vez que se ha extraído el fémur, retire cualquier tejido adicional y coloque el fémur en un pequeño recipiente con nuestro medio PMI. Al eliminar el tejido adicional, asegúrese de que el hueso del fémur no se seque.

En este momento, los huesos de fémur deben transferirse a una placa que contenga etanol al 70% y colocarse sobre hielo durante cinco a 10 minutos. Para fines de este video, continuaremos sobre la mesa de laboratorio. Sin embargo, en esta etapa del experimento, todo debe transferirse a una cabina de cultivo celular.

Una vez que los huesos hayan sido remojados en etanol, puede trasladarlos a un recipiente más grande con medio estéril para la extracción de la médula ósea. Ahora estamos listos para extraer y resuspender la médula ósea. Llene una jeringa de insulina con medio estéril y colóquela a un lado para su uso posterior.

Sujete el hueso con pinzas estériles. Sosténgalo sobre una placa pequeña para piezas descartadas y corte la epífisis o los extremos del hueso por cada lado. Introduzca la jeringa de insulina en uno de los extremos del hueso y expulse la médula ósea fuera del hueso en 15 mililitros de medio.

Lave el hueso una o dos veces más hasta que se haya eliminado toda la médula. Una vez que la médula haya sido eliminada del hueso, este será casi completamente blanco. Coloque el hueso limpio en el recipiente de desecho y repita el proceso con el otro fémur.

Una vez completado esto, desintegre suavemente cualquier fragmento de médula que no se haya separado durante el proceso de lavado para obtener una suspensión de células individuales. Esto requerirá de cinco a diez minutos de pipeteo. Coloque la suspensión de células individuales en un tubo cónico de 50 mL y lave la placa al menos tres veces con 10 mL de medio.

Cada vez, centrifugar las células, eliminar el medio y resuspender las células presionando firmemente y rápidamente los dedos contra el fondo del tubo. Para eliminar los glóbulos rojos o GR, realizamos una lisis con agua. Otro método para la eliminación de glóbulos rojos es la lisis con cloruro de amonio.

Ambos métodos han sido descritos en artículos previos de video de JoVE. Aislamiento de células T CD4 positivas de ganglios linfáticos de ratón utilizando el sistema de purificación Milan max, número de JoVE 9, y la preparación del factor de crecimiento de células T a partir de células de rata, número de JoVE 10.

Tras la eliminación de sus glóbulos rojos, ya están listos para ser cultivados. Antes de guiarlos a través del cultivo de células dendríticas, me gustaría presentarles el sitio incus. El sitio incus permitirá observar el crecimiento de las células cultivadas dentro del incubador, de modo que podamos ver cómo se comportan o se comportan inadecuadamente.

Una vez que se ha establecido un cultivo, se coloca en la bandeja del tamaño adecuado y se desliza el sitio del incus para cerrarlo. Luego, en su computadora, simplemente establezca el intervalo de tiempo, elija los pocillos que desea imaginar y deje que el sitio inky recoja los datos por usted. Las películas que se mostrarán en este protocolo demuestran los cambios en la morfología de las células dendríticas in vitro.

Estos videos se exportaron directamente del programa del sitio Incus. A medida que las células dendríticas se desarrollan desde el día uno hasta el día 11, se puede observar un cambio verdadero en la morfología, ya que aumentan de tamaño y adquieren el fenotipo de célula dendrítica. Después de lisar los glóbulos rojos y eliminarlos, las células se lavan en medio primario para células dendríticas y se siembran a 5 millones por mililitro.

Estas células deben cultivarse inicialmente en medio de cultivo de células dendríticas primarias, y posteriormente las cultivaremos en medio secundario de CD, suplementado con 40 nanogramos por mililitro de IL-4 y 100 nanogramos por mililitro de TNF-alfa. Estas citocinas favorecerán el desarrollo de células dendríticas maduras que se asemejan a las células dendríticas derivadas de monocitos. Ahora voy a mostrarles cómo se ven los cultivos durante su desarrollo y cómo mantenerlos con el tiempo.

Una vez que haya sembrado las células, puede cultivar las células dendríticas durante 72 horas antes del primer cambio de medio. Así es como se verá su cultivo típico justo después de sembrar las células en el día uno. Y así se observan las células.

El día tres, puede observarse que las células han comenzado a adherirse a la placa pero aún no han adquirido el fenotipo clásico de célula dendrítica. El día cuatro, retire el medio y agregue 10 mililitros de medio fresco para DC primarias mediante la aspiración del medio. El día cuatro, eliminaremos los linfocitos y cualquier otra célula no adherente.

Ahora pueden colocar las placas de nuevo en el incubador durante otros tres días, siete días después del siembra inicial. Así es como se verá su cultivo típico. Pueden observar que es momento de dividir las células y resembrarlas.

En el día siete, las células dendríticas se retiran de la placa aspirando el medio y luego agregando EDTA estéril 300 milimolar e incubando durante cinco minutos. A continuación, se enjuaga repetidamente la placa manteniéndola en un ángulo de 45 grados y pipeteando la solución de EDTA contra la parte posterior de la placa. Este procedimiento se realiza durante varios minutos para asegurar la eliminación de todas las células dendríticas adherentes.

Las células se recogen en un tubo cónico de 50 mililitros y se lavan dos veces con medio de DC secundario. Luego, las células se resuspenden y siembran a 5 millones de células por placa. Las células dendríticas del día siete recién sembradas se asientan rápidamente en el fondo de la placa, se adhieren y comienzan a extenderse.

Como puede observarse en el video del sitio Zichy, este video fue grabado en el incubador durante dos días para mostrarle el desarrollo de las células dendríticas desde el replante inicial realizado en el día siete hasta principios del día nueve. Las células dendríticas morfológicas pueden activarse mediante un pulso de antígeno al agregar dos microgramos por mililitro de LPS junto con cien microgramos de ova para su uso con linfocitos T purificados de ratones OT dos, que poseen linfocitos T CD cuatro positivos específicos para ova. Si está utilizando un antígeno diferente, es importante asegurarse de emplear una concentración óptima de antígeno para el pulso de sus CD aquí; el OVA y el LPS se añaden al medio primario de manera que la concentración final de LPS será de dos microgramos por mililitro en 20 mililitros, y la de OVA será de cien microgramos por mililitro en 20 mililitros.

Aquí hay una fotografía de cómo se ve un cultivo típico de células dendríticas del día 10. En esta imagen se puede observar que la morfología es muy característica de una célula presentadora de antígenos. Siempre debe verificar el porcentaje de células dendríticas positivas para CD11c mediante citometría de flujo.

Esto garantiza que se tenga una cultura relativamente pura de células dendríticas para su uso en los experimentos. Aquí utilizamos el sitio inky de SEN Instruments para monitorear la activación de las células dendríticas que fueron tratadas con LPS y pulsadas con antígeno en el día 10. Este video abarca un período de 24 horas inmediatamente después de la adición de LPS y del péptido val, durante el cual las células dendríticas se vuelven más activas y presentan algunos cambios morfológicos evidentes.

Una vez que sus células dendríticas hayan sido activadas en el pulso de antígeno, puede volver a recolectarlas mediante incubación con EDTA 300 milimolar y lavado de la placa. Ahora centrifugue sus células, lávelas dos veces con 50 ml de medio RPMI para eliminar cualquier antígeno adicional y márquelas con el colorante adecuado para seguimiento celular. En este experimento, estaré realizando imágenes de las células en el ganglio linfático inguinal.

Necesitaremos inyectar entre dos y cinco millones de células dendríticas dérmicamente en la región del flanco del ratón mostrado aquí. Luego, permitimos 24 horas para que las células dendríticas migren hacia el ganglio linfático diana. En este video, las células dendríticas están marcadas con CMF dos hc, un colorante azul para el seguimiento celular.

Puede observarse cómo las células dendríticas interactúan con linfocitos T marcados que son específicos para el antígeno volin. Estos linfocitos T están marcados con CCF SE. También puede utilizarse C-M-T-M-R o cualquiera de los otros colorantes rastreadores celulares como sondas moleculares. Esta es la etapa temprana de activación de los linfocitos T que interactúan con las CD.

Dado que son específicas para el antígeno, puede observarse que las células T se adhieren a los prolongaciones de las DC etiquetadas en azul. Esto concluye nuestro protocolo que demuestra la preparación y el uso de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón en un experimento de imagen de dos botones. Gracias por ver este video y buena suerte con sus propios experimentos.