Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

La elegancia marina es un organismo modelo increíblemente útil debido tanto a nuestro conocimiento de sus linajes celulares como a la gran cantidad de información obtenida al secuenciar y analizar todo su genoma. En este video, demostramos el proceso de microinyección de plásmidos en la elegancia marina y la selección de descendencia transgénica utilizando microscopía de fluorescencia. Al ser un animal transparente y multicelular, la elegancia marina es ideal para visualizar transgenes que expresan proteínas marcadas con fluorescencia in vivo. Hola, mi nombre es Laura Berkowitz y soy investigadora asociada en el Laboratorio Caldwell, del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama.

Y yo soy Adam Knight, también del Laboratorio Calwell en la Universidad de Alabama. Hoy les mostraré cómo prepararse y realizar la microinyección de plasmina para generar ejemplares transgénicos de *C. elegans*, y también cómo seleccionar y mantener líneas transgénicas de *C. elegans*. Comencemos.

Antes de comenzar la microinyección, tenemos algunos pasos de preparación que les mostraré ahora. Primero, prepare el ADN plasmídico que se va a inyectar; se requieren dos plásmidos, uno que codifique la expresión específica del tejido de nuestro gen de interés y un segundo que proporcione un marcador de transformación seleccionable. Mezcle los plásmidos juntos en una proporción uno a uno de 50 nanogramos por microlitro.

A continuación, prepare almohadillas de tornillo, que se utilizarán para inmovilizar los gusanos durante la inyección. Para fabricar las almohadillas de tornillo, coloque primero varias cubreobjetos de 22 por 50 milímetros sobre la superficie de trabajo. Con una pipeta Pasteur, coloque una gota de agarosa al 2% fundida sobre un cubreobjetos y, de inmediato, coloque un segundo cubreobjetos sobre la gota formando un ángulo de 90 grados respecto al primero.

Deje que el aero se solidifique durante unos segundos y luego retire el cubreobjetos superior. El diámetro del disco aplanado de aero debe estar entre 15 y 20 milímetros. Como si fuera una mascota, deje que la almohadilla se seque al aire por completo durante varias horas o durante la noche.

Una vez que estén secos, almacene las placas en una caja de cubreobjetos a temperatura ambiente. A continuación, prepare las cargas para aguja con la solución de ADN. Para ello, tome un tubo capilar de cien microlitros y cálientelo en la mitad con una llama abierta, luego estírelo rápidamente hasta aproximadamente el doble de su longitud.

Una vez que el tubo capilar se enfríe, sepárelo en dos mitades con un movimiento brusco. Acumule de 10 a 20 cargadores de aguja para la inyección. Pueden almacenarse en posición vertical dentro de un tubo de microcentrífuga.

Brack, tenga cuidado. Los extremos del cargador de agujas son muy afilados. Ahora fabrique las agujas de microinyección.

Estas agujas están hechas de un tubo capilar especial que contiene un filamento interno de vidrio. Este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Para fabricar las agujas, utilizamos una Niki PP ocho 30 Polar con un ajuste de calor de 24,8, y se extraen varias agujas a la vez para su almacenamiento.

Pueden montarse múltiples agujas sobre una tira de arcilla para modelar. Se utilizarán pequeños fragmentos de cubreobjetos para romper la punta de la aguja estirada. Estos fragmentos se preparan envolviendo un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros en una toalla Kim y aplicando presión suavemente hasta que se rompa en varias piezas.

Utilice fragmentos de aproximadamente tres por cuatro milímetros de tamaño. Además de preparar el ADN y las agujas, prepare alrededor de 50 a 100 ejemplares adecuadamente estadiados. Dos gusanos de tipo silvestre por cada construcción de vector de expresión que se vaya a inyectar.

Ahora estamos listos para configurar el microscopio de microinyección. Para comenzar la configuración del microscopio, abra la válvula principal del tanque de helio que está conectado al brazo y soporte de la aguja de microinyección. Cierre el regulador para permitir que el gas entre en la línea.

Llevando la presión a 35 PSI, el gas puede liberarse utilizando un pedal de pie. A continuación, inserte un cargador de aguja en un tubo de pipeta de boca estándar y coloque una pequeña cantidad de la mezcla de plásmido, aproximadamente un microlitro. Ahora, inserte suavemente el cargador completamente a través de la aguja de microinyección hasta sentir resistencia.

Expele la solución de ADN mediante soplido suave y luego retire el cargador. Una vez cargado el ADN, inserte la aguja en el brazo de microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la pequeña junta de goma interna y luego sujétela al brazo del manipulador. A continuación, coloque un fragmento de vidrio de cubreobjetos para romper agujas en un borde de la almohadilla de tornillo sin fin.

Cubra el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de auga, con aceite de carbono hueco. Luego, coloque la almohadilla de auga sobre la platina de un microscopio invertido. Una vez que la almohadilla de auga esté colocada, posicione la aguja en el centro del campo de visión utilizando el objetivo Forex y la iluminación de campo claro, pero aún no la baje hasta el aceite.

A continuación, coloque el borde interno del fragmento de cubreobjetos en el centro y enfoque sobre él. Baje la aguja dentro del aceite, llevándola al mismo plano focal que el fragmento de cubreobjetos. Aumente el aumento cambiando al objetivo de 40 x, luego vuelva a enfocar el borde del fragmento y reposicione la punta de la aguja si es necesario.

Ahora rompa la punta del aguja de inyección. Empuje suavemente la aguja contra el borde del fragmento de cubreobjetos, mientras al mismo tiempo aplica un breve pulso de gas mediante el pedal. La aguja quedará suficientemente abierta.

Cuando pequeñas gotas de líquido escapan por el extremo de la aguja debido a un flujo excesivo provocado por una abertura demasiado grande, esto no es deseable ya que matará a los animales. Una vez que la aguja esté lista, comenzamos la microinyección. A continuación, retire la almohadilla del husillo del platino elevando la aguja.

Pero no cambie la posición de los ejes X o Y. Deslice la platina desde debajo de la aguja. Retire la almohadilla helicoidal y colóquela bajo un microscopio de disección.

Transfiera una palabra al pad debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce suavemente, acaríciele hasta que haga contacto con el pad del sacabocados; el gusano húmedo debe adherirse al agro seco. Coloque rápidamente el pad del sacabocados de nuevo sobre la platina, centrando el gusano en el campo de visión.

Luego baje la aguja hasta el mismo plano de enfoque que el gusano. Cambie los filtros del microscopio invertido a iluminación Hoffman. Este filtro de contraste permite que los detalles morfológicos del gusano sean visibles.

Utilizando el objetivo de 40 x, enfoque el centro sensorial granular de la gónada del gusano debajo del patrón de panal de los núcleos germinales. Elija la gónada que esté situada en el lado del gusano que mira hacia la aguja. Ajuste finamente la posición de la aguja hasta que la punta también esté enfocada.

Inserte suavemente la aguja en el centro del gonada y aplique un breve pulso de presión de gas para expulsar una o dos gotas de ADN dentro del brazo del gonada. Con mucha práctica y habilidad, debería observar una onda de líquido extendiéndose a través del gonada distal. Puede impactar el centro del gonada cada vez.

Tenga en cuenta que es importante trabajar rápidamente al inyectar un gusano, ya que puede desecarse fácilmente. Todo el proceso debería tardar idealmente menos de uno a dos minutos.

Una vez finalizada la inyección, retire la almohadilla del tornillo sinfín del portaobjetos y colóquela bajo un microscopio estereoscópico. Aplique un microlitro de tampón M nueve directamente sobre el gusano inyectado. Esto podría requerir sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halo carburo.

El tampón debe rehidratar al gusano y este entonces flotará sobre la superficie del disco de aeros; transfiera el gusano a una placa convencional utilizando un punzón para gusanos. Ahora entregaré los gusanos inyectados a Adam, y él nos mostrará la selección y el mantenimiento de líneas transgénicas. Los gusanos inyectados se transfieren a placas individuales de 60 milímetros con siembra fresca y se les permite reproducirse.

Estos gusanos representan la generación P cero. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan los descendientes. Una vez que aparecen los descendientes, estamos listos para comenzar a seleccionar gusanos transgénicos.

Se observan los descendientes F1 en busca de evidencia del marcador transgénico. En este caso, el marcador seleccionable es fluorescente, por lo que podemos realizar el tamizaje utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Cada animal portador fluorescente de la generación F1 se clona por separado en una placa nueva.

El P cero inyectado puede producir solo de uno a cinco descendientes fluorescentes entre todos sus F1. Deje que los hermafroditas F1 se reproduzcan a 20 grados durante dos o tres días hasta que aparezca la descendencia. Una vez que la generación F2 esté lista, también se observa la presencia de animales transgénicos. Los animales F2 que han heredado y expresado un marcador transgénico se consideran una línea estable.

Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de gusanos; propague cada línea transfiriendo varios animales transgénicos a una nueva placa en cada generación. Esto debe realizarse utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Si el marcador seleccionable es fluorescente, para controlar la variabilidad en el número de copias del gen, genere al menos tres líneas estables independientes por cada constructo inyectado.

Acabamos de mostrarle cómo microinyectar vectores de expresión, construcciones vectoriales y ver elgan, y cómo seleccionar líneas estables. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.