La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Hola, soy Randall Hoffman, estudiante de posgrado en el Laboratorio de Susan Linus del departamento de biología del MIT. Hoy les voy a presentar la electroforesis en gel con detergente semidesnaturalizante, o SDD-AGE. Nuestro laboratorio utiliza esta técnica para detectar priones y otras proteínas alo génicas.

Nuestra versión de la edad SDD es sencilla y confiable, y puede ampliarse para acomodar cualquier número de muestras. Los amiloideos son excepcionalmente resistentes a la desnaturalización por SDS, lo que permite separarlos de otras proteínas mediante SDDH. Sin embargo, los datos obtenidos de SDDH no pueden utilizarse por sí solos para confirmar que algo es un amiloide.

Para hacerlo, es necesario utilizar otras técnicas. Con ese fin, permítame mostrarle. S-D-D-H-S-D-D-H puede realizarse utilizando equipo estándar para electroforesis horizontal de ADN.

Primero, debe ensamblar la bandeja para moldear geles. El tamaño del aparato dependerá de la cantidad de muestras que tenga. Para un gran número de muestras, utilizamos una placa de 20 por 24 centímetros y hasta cuatro peines de 50 pozos.

Para preparar el gel, necesitará agarosa de baja EEO con fuerza media o alta, tampón 1XTAE y una solución stock al 10% de SDS. Prepare una solución de agarosa al 1,5% y 1XTAE. Deberá hacer el gel lo más grueso posible para poder cargar la mayor cantidad de muestra y maximizar la detección. Caliente la mezcla en el microondas hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.

Agregue rápidamente el stock de XSDS 100 a 0,1 % y agite suavemente para mezclar. Si algo de agros se solidifica durante este paso, caliente nuevamente en una placa calefactora para disolverlo. Tenga cuidado de no dejar que hierva.

Después de agregar SDS, como la solución puede desbordarse fácilmente con burbujas, vierta esta solución en la bandeja de colado mientras aún esté caliente. Luego, utilice un peine para eliminar cualquier burbuja que pudiera interferir posteriormente durante la transferencia del gel. Una vez que el gel se haya enfriado completamente y solidificado, retire cuidadosamente los peines y coloque el gel en el tanque.

Sumerja completamente el gel en un XTAE con SDS al 0,1 %. Ahora está listo para cargar sus muestras. Las muestras de proteínas utilizadas en SDDH se preparan de la misma manera que en un SDS-PAGE, con dos excepciones importantes.

Primero, debe evitar calentar las muestras, ya que esto podría desnaturalizar los agregados en monómeros proteicos. Segundo, tenga cuidado para evitar la degradación proteica. Dado que las condiciones desnaturalizantes utilizadas aquí no son suficientes para inactivar todas las proteasas, recomendamos usar al menos el doble de la concentración recomendada de un cóctel completo de inhibidores de proteasas.

En esta demostración, utilizaremos lisados de células de levadura que sobreexpresan una proteína particular de interés. Generalmente usamos dos ml de cultivo nocturno. Los cultivos se crecen en bloques de 96 pocillos disponibles en VWR, pero al analizar proteínas de baja abundancia, deben usarse volúmenes mayores de cultivo.

Recoger las células mediante centrifugación del cultivo a 2000 RCF durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar las células resuspendiéndolas en agua y centrifugando nuevamente. Tras la segunda centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en solución de siembra fresca. La enzima en la solución digiere las paredes celulares, lo que le permitirá lisar eficientemente las células con un pequeño volumen de tampón de lisis. Incubar durante 30 minutos a 30 grados Celsius.

Centrifugue las células plásticas sobrantes esta vez a 800 RCF durante cinco minutos. Retire completamente el sobrenadante y re suspenda cada precipitado en 100 microlitros de tampón de lisis. A continuación, cubra el bloque con cinta y vortexee a alta velocidad durante dos minutos.

Esto ayuda a que todos los plásticos de las esferas LYP salgan junto con los restos celulares a 4.000 RCF durante dos minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a una placa PCR de 96 pocillos.

Típicamente, analizamos cientos de muestras a la vez en nuestro laboratorio, por lo que para ayudarnos con esto utilizamos un sistema de manipulación de líquidos. Si se desea, determine la concentración de proteína de los lisados. A continuación, agregue tampón de muestra 4x a las muestras para generar lisados que contengan tampón de muestra 1x e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Ahora cargue las muestras en el gel. Si se desea, guarde la mitad de las muestras para el análisis por electroforesis SDS-PAGE. Además, cargue marcadores de peso molecular, incluyendo marcadores preteñidos y un marcador de peso molecular muy alto, como el extracto de flector de pollo.

Si se desea, es importante mantener el gel frío para evitar la difusión de proteínas de bajo peso molecular, por lo que puede ser conveniente hacerlo correr en una cámara fría. Haga correr el gel a baja tensión, inferior a tres voltios por centímetro de longitud del gel. Corra el gel durante varias horas hasta que el frente de tinte alcance aproximadamente un centímetro del extremo del gel.

Dado que el amiloide no se desnaturaliza con SDS al 2 % a temperatura ambiente, permanecerá intacto mientras que otros complejos, incluyendo la mayoría de agregados no amiloides, se disocian en presencia de SDS al 2 %. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas serán monoméricas y migrarán rápidamente a través del gel. Mientras que los amiloides de alto peso molecular resistentes al SDS migrarán más lentamente.

Después de esto, el gel estará listo para la transferencia. Aunque se pueden usar múltiples métodos de transferencia, obtenemos los mejores resultados utilizando la transferencia capilar. Dado que la transferencia capilar puede acomodar cualquier tamaño de gel, es práctico analizar cientos de muestras mediante transferencia capilar.

Una pila de papeles absorbentes secos sirve para extraer el tampón a través del gel, depositando las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa colocada entre los papeles y el gel. Deberá cortar un trozo de nitrocelulosa, como la marca High Bond C, con las mismas dimensiones que el gel. También necesitará cortar 20 piezas de papel absorbente GBO oh cuatro y ocho piezas de papel absorbente GBO oh dos del mismo tamaño que el gel.

El GB oh cuatro es muy grueso y absorbente. Mientras que el GBO oh dos es mucho más delgado y tiene una textura más fina, lo que garantiza un contacto más uniforme con la membrana. Corte una pieza adicional de GBO oh cuatro para usarla como mecha y hágala aproximadamente 20 centímetros más ancha que el gel sumergido.

El UL WIC nitroso y cuatro piezas de GBO oh dos y un XTBS en un recipiente de plástico arman una pila de papeles de la siguiente manera: 20 piezas de GBO oh cuatro secas. Luego, cuatro piezas de GBO oh dos secas. A continuación, una pieza de GBO oh dos previamente humedecida.

Coloque la nitrocelulosa encima de este conjunto. Enjuague brevemente el gel en la bandeja de moldeo con agua para eliminar el exceso de tampón de electroforesis. Luego, comience cuidadosamente a deslizar el gel fuera de la bandeja hacia el conjunto, deslizando el gel fuera de la bandeja hacia abajo sobre la membrana con TBS según sea necesario.

El tampón adicional ayuda a evitar que las burbujas queden atrapadas en el gel. La pipeta de transferencia funciona bien para este propósito después de que el gel se haya movido completamente a la pila. Revise minuciosamente en busca de burbujas, en caso de que haya alguna.

Levante el borde del gel y vuelva a aplicar tampón hasta que se eliminen las burbujas. Coloque las tres piezas restantes de GBO oh dos previamente humedecidas encima del gel. Asegure un contacto completo entre todas las capas rodando firmemente una pipeta sobre la parte superior de la pila.

Coloque la pila de transferencia entre dos bandejas elevadas que contengan TBS; extienda la mecha previamente humedecida a través de la pila, de modo que ambos extremos de la mecha queden sumergidos. En TBS, cubra la pila de transferencia ensamblada con una bandeja de plástico adicional que lleve un peso extra, como una botella de agua de 500 ml. La mecha extraerá tampón de las bandejas y los papeles de blotting secos arrastrarán el tampón a través del gel durante varias horas.

Esto depositará las proteínas sobre la membrana; permita que la transferencia continúe durante un mínimo de tres horas o durante la noche. Una vez completada la transferencia por capilaridad, la membrana puede procesarse mediante un inmunotransferido (western blot) estándar. Aquí se observa una tinción típica de proteínas que fueron sobreexpresadas en una cepa de levadura que predispone a ciertas proteínas a formar amiloide.

Puede observarse claramente que algunos de nuestros candidatos forman muy bien especies resistentes al SDS de alto peso molecular o amiloideas, como las mostradas aquí y aquí. Otros, sin embargo, no forman agregados y son completamente monoméricos, como estos y estos. Además, puede verse que el tamaño de los polímeros amiloides varía según la proteína, lo cual puede observarse en estas dos bandas.

Acabamos de mostrarle un método sencillo para analizar agregados de alto peso molecular e insolubles, como los amiloideos de priones candidatos. Esperamos que haya disfrutado de nuestra presentación y que encuentre esta técnica útil para estudios de proteínas inmunogénicas de Amy. Gracias por vernos y mucha suerte en su investigación.