Inmunoprecipitación de ADN metilado

Este video demuestra un protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado o meetup. Un método utilizado para aislar específicamente ADN metilado de manera imparcial. La metilación del ADN en mamíferos se caracteriza por la adición de un grupo metilo a la posición C cinco de la citosina.

Cuando está presente en un dinucleótido CPG, constituye una marca epigenética reversible que desempeña un papel importante en el desarrollo normal, así como en varios procesos de enfermedades. Las funciones normales de la metilación del ADN incluyen la inactivación del cromosoma X en hembras, el silenciamiento de elementos repetitivos, la impronta genómica y el mantenimiento de la estabilidad genómica. También se ha demostrado que la metilación del ADN desempeña un papel en numerosas enfermedades, como el cáncer, el síndrome de Prader-Willi, el síndrome de ICF (inmunodeficiencia, inestabilidad centromérica y anomalías faciales) y el síndrome de Rett.

En los cánceres, por ejemplo, la hipermetilación anormal y los promotores pueden provocar la silenciamiento de genes vitales supresores de tumores. Mientras que la hipometilación inadecuada provoca inestabilidad cromosómica y activación de oncogenes, el encuentro se logra primero mediante la sonicación del ADN en fragmentos cuyo tamaño oscila entre 300 y 1000 pares de bases. Luego, el ADN sonicado se desnaturaliza a 95 grados Celsius.

Se añaden anticuerpos primarios, que reconocen la pentametacina, y se permite su unión a fragmentos de ADN metilado. Se utilizan anticuerpos secundarios conjugados a bolas magnéticas Dyna para aislar fragmentos de ADN que han sido unidos por el anticuerpo primario. Los fragmentos no metilados se eliminan y los anticuerpos se digieren mediante proteinasa.

La limpieza con fenil cloroformo de KA elimina la proteína digerida y la precipitación purifica el ADN, que ahora está enriquecido en fragmentos metilados. El ADN purificado puede utilizarse en aplicaciones como PCR, microarreglos y secuenciación. El procedimiento generalmente se realiza en dos días.

El día uno comprende la preparación del ADN, la sonicación, la inmunoprecipitación y la digestión proteica. El día dos incluye la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación con etanol para purificar y aislar el ADN enriquecido en metilación. Se requieren algunos materiales especiales para el procedimiento, incluyendo tubos centrífugos silanizados, un dispositivo de sonicación de ADN, un anticuerpo primario, anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina de ratón, un anticuerpo secundario, perlas DynaBeads conjugadas con anticuerpo secundario de oveja anti-IgG de ratón y un soporte magnético para tubos.

El primer paso en el protocolo Meetup es la preparación del ADN. Es fundamental evaluar la naturaleza del ADN previamente. Conocer el estado del ADN de la muestra, si es principalmente bicatenario o monocatenario, es necesario, ya que la cuantificación precisa de la muestra es de suma importancia y diversos métodos para determinar la cantidad de ADN pueden verse afectados negativamente por la presencia de especies de ADN no deseadas.

La cantidad de ADN bicatenario se puede evaluar fácilmente mediante fotometría espectral utilizando un NanoDrop 3, 300 nd cargue 1.5 microlitros y configure el tipo de medición en ácido nucleico, seleccione ADN 50 como cálculo e inicialice el instrumento con 1.5 microlitros de agua. Limpie los pedestales y enrasé el instrumento con 1.5 microlitros del líquido. La muestra se disuelve en limpie los pedestales, cargue 1.5 microlitros de la muestra y pulse medir.

Se proporcionará la concentración y se puede utilizar. Para calcular el número de microlitros necesario para mí, sumerja un A dos 60 a dos 80 con una relación de 1,8, lo cual es ideal aquí. Se prepara una muestra de un microgramo.

Sin embargo, una muestra de tan solo 200 nanogramos es suficiente para obtener resultados exitosos. Para la reunión, cargue la muestra de ADN en un tubo limpio silanizado. Añada agua estéril suficiente para llevar el volumen final a 50 microlitros.

La sonicación del ADN y la inmunoprecipitación deben realizarse en tubos silanizados para evitar la unión no específica de ADN y proteínas a las paredes de los tubos. Una vez que el ADN ha sido preparado, la muestra debe ser sonicada; la sonicación es necesaria para fragmentar el ADN, ya que la inmunoprecipitación es más eficiente con fragmentos más pequeños de ADN. Cargue la muestra en el sonicador, asegúrese de que la configuración de potencia esté en alto y de que la máquina esté programada para 30 segundos. Tras 30 segundos de pausa, llene la base hasta la línea de llenado con agua a cuatro grados Celsius.

Sonicar la muestra durante siete minutos. Cuando finalice la sonicación, retire el tubo y colóquelo en hielo. Es importante optimizar las condiciones de sonicación para su muestra prevista y el tamaño del ADN de antemano.

Por ejemplo, una muestra de ADN parcialmente degradada requerirá un tiempo de sonicación más corto. Los productos de la sonicación pueden visualizarse mediante técnicas electroforéticas estándar. En este momento, se desean fragmentos de ADN cuyo tamaño oscile entre 300 y 1000 pares de bases para su uso posterior.

En los ensayos de microarreglo y PCR, debe reservar una quinta parte del ADN como ADN de entrada o de referencia; en este caso, se utilizarán 800 nanogramos de ADN sonicado para la inmunoprecipitación y el resto se guardará como ADN de referencia. El siguiente paso en el protocolo es la reacción de inmunoprecipitación o IP; antes de añadir el anticuerpo primario, el ADN debe desnaturalizarse. La desnaturalización es necesaria porque el anticuerpo primario es sensible al ADN de cadena sencilla.

Coloque la muestra en un baño de agua a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Cuando el paso de desnaturalización esté completo, transfiera inmediatamente el tubo a hielo durante al menos cinco minutos. Esto evitará que el ADN desnaturalizado se repliegue y permitirá una unión óptima de los anticuerpos cuando la muestra se haya enfriado.

Centrifugar brevemente el tubo para reunir el contenido en el fondo. A continuación, se debe agregar el anticuerpo primario. La cantidad de anticuerpo utilizada debe titrarse para cada lote y para cada fabricante.

En este caso, agregamos cinco microgramos de anticuerpo primario y luego añadimos tampón de inmunoprecipitación o tampón IP hasta un volumen final de 500 microlitros. A continuación, el ADN de IP se coloca en un rotador y se deja incubar a cuatro grados Celsius durante dos horas. La rotación es necesaria para evitar la conglomeración del anticuerpo dentro del tubo durante la incubación.

Aproximadamente 15 minutos antes de que finalice la incubación con el anticuerpo primario, limpie y prepare las perlas magnéticas Dyna. Primero, suspenda completamente las perlas en el vial mediante vortex. Luego, transfiera 30 microlitros de perlas a un tubo limpio silanizado y coloque ese tubo en un soporte magnético para múltiples reacciones.

Transfiera 30 microlitros de perlas por reacción, más la cantidad suficiente para una reacción adicional para permitir errores de pipeteo o pérdida inadvertida de algunas perlas. Por ejemplo, para ocho reacciones, retire la cantidad suficiente de perlas para nueve reacciones o 270 microlitros.

Las perlas magnéticas se desplazarán hacia la pared del soporte magnético. Espere dos minutos para que las perlas migren y se asienten formando una franja definida en la pared del tubo. A continuación, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, asegurándose de no perturbar las perlas en la pared posterior con la punta de la pipeta.

Sustituya el sobrenadante por un volumen excesivo de tampón de IP, vortexee y colóquelo de nuevo en el soporte magnético durante dos minutos. Repita este lavado una vez más y resuspenda las perlas de lavado en su volumen original de tampón de IP. Retire el tubo de muestra del rotador cuando finalice la incubación.

Para completar la inmunoprecipitación, agregue 30 microlitros de perlas limpias a la reacción y coloque el tubo nuevamente en un rotador durante dos horas a cuatro grados Celsius. Durante esta incubación, el anticuerpo secundario, que es anti ratón IgG, se unirá al anticuerpo primario de ratón. Los anticuerpos anti ratón están conjugados a perlas magnéticas Dyna, lo que permite una fácil recuperación de los productos unidos y el siguiente paso de purificación.

Una vez finalizada la incubación con ambos anticuerpos, coloque el tubo de inmunoprecipitación en el soporte magnético durante dos minutos. En este momento, el ADN metilado estará unido al anticuerpo primario, el cual a su vez estará unido al anticuerpo secundario conjugado con perlas Dyna. Retire y deseche el sobrenadante y reemplácelo con 500 microlitros de tampón de inmunoprecipitación.

Mezcle el contenido del tubo y colóquelo de nuevo en el soporte durante dos minutos. Repita este lavado con el tampón IP una vez más. Después de eliminar el sobrenadante del último lavado Resus, suspenda las perlas por última vez.

En 400 microlitros de tampón de digestión, trate la reacción con 100 microgramos de proteinasa K e incube durante la noche a 50 grados Celsius. El tratamiento con proteinasa K es necesario para digerir las proteínas de los anticuerpos y cualquier proteína residual asociada con el ADN, permitiendo que el ADN metilado se libere en solución. La purificación de ADN se lleva a cabo el segundo día del procedimiento de reunión; retire el tubo de digestión del incubador.

En una campana extractora, agregue 500 microlitros de fenol-cloroformo uno a uno a pH siete al tubo y mezcle completamente mediante vortex. Centrifugue el tubo durante 10 minutos a 13.000 ×g. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior del tubo sin perturbar la interfase ni eliminar ninguna parte de la capa orgánica. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo.

Puede realizarse una segunda extracción si la interfase aparece turbia. A continuación, agregue un volumen igual a un décimo del volumen inicial de acetato de sodio tres molar; en este caso, 40 microlitros. Se puede usar un microlitro de glicógeno como agente transportador para facilitar la limpieza del precipitado.

Vortexee el tubo para mezclar el contenido. A continuación, agregue dos volúmenes de etanol al 100 %, vortexee y congele en un congelador a menos 20 grados Celsius durante 20 minutos después de congelar. El ADN precipitado se centrifuga en una centrífuga a 13.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Se formará un pellet de ADN en el fondo del tubo. Retire el tubo del centrífugo y elimine el etanol. Tenga cuidado de no perturbar el pellet en el fondo del tubo.

Puede ser necesario un centrifugado breve para eliminar cualquier etanol residual. Para lavar el precipitado, añada 500 microlitros de etanol frío al 70 %, vortexee y centrifugue nuevamente durante 20 minutos a 13 000 ×g y 4 °C. Cuando finalice la segunda centrifugación, elimine el etanol al 70 % con un centrifugado breve y retire el etanol residual con una pipeta.

Deje el tubo en un portaobjetos con la tapa abierta para secar el precipitado y permitir que el etanol restante se evapore. Finalmente, reuspenda el precipitado que contiene solo ADN enriquecido para metilación en 10 microlitros de agua estéril, permitiendo tiempo suficiente para que el precipitado de ADN se disuelva antes de su uso. Es una buena práctica validar la eficiencia del aislamiento mediante PCR.

Esto puede realizarse mediante reacciones de PCR diseñadas para amplificar productos que ilustren diferencialmente fragmentos de ADN metilados y no metilados utilizando cebadores para ADN humano normal. La región de control de impresión H19 puede utilizarse junto con cebadores diseñados para amplificar una región del genoma que no está metilada. En el protocolo adjunto se pueden encontrar ejemplos de secuencias de cebadores y condiciones de ciclado de PCR.

En este momento, es necesario recuperar el ADN de entrada o de referencia que se reservó al comienzo del protocolo de reunión. Se preparará un conjunto de reacciones de PCR utilizando el ADN de entrada, y otro conjunto utilizando el ADN de IP enriquecido en metilación. Si la reunión fue exitosa, la PCR de IP producirá un producto utilizando los cebadores de metilación y ningún producto utilizando los cebadores de control.

Por el contrario, la PCR de entrada debería producir productos utilizando ambos cebadores, ya que contiene fragmentos de ADN metilados y no metilados. El ADN enriquecido en fragmentos metilados puede utilizarse en diversas aplicaciones posteriores, como la secuenciación por PCR y el análisis mediante microarreglos.

Cuando se combina con otras técnicas de biología molecular, puede utilizarse para investigar el estado de metilación del ADN de manera específica por locus o a nivel del genoma completo, con el fin de realizar perfiles de metilación o estudiar la epigenómica.