Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Mi nombre es María y trabajo en Y Healthcare en NOS, Suecia. Las proteínas de la superficie celular suelen estar involucradas en la comunicación entre las células y su entorno, por lo que son de particular interés en la investigación, con el objetivo de obtener mayor conocimiento sobre enfermedades, así como otras variaciones biológicas inducidas por cambios en el entorno celular. En este video, les mostraré un protocolo sencillo de etiquetado de superficie celular mediante la técnica side-eye dodge, que les permitirá enriquecer visualmente estas proteínas de baja abundancia sin necesidad de amplificación física y estudiar las diferencias de estas proteínas de superficie celular mediante esta tecnología.

Si encuentra esta tecnología interesante, puede obtener más información en el manual 2D. Además, disponemos de una nota de aplicación sobre este tema en particular, que puede descargar de job. En el protocolo de etiquetado de la superficie celular que se muestra en la parte superior, usted etiqueta las células mientras aún están intactas. Durante el proceso de etiquetado, el colorante solo tendrá acceso a las proteínas de la superficie celular.

Después del paso de marcado, las células se analizan para verificar el marcado específico en la superficie celular. La muestra marcada se fraccionó en proteínas de membrana y proteínas citosólicas. Se preparó en paralelo una muestra no fraccionada.

Para comparación, este análisis de fraccionamiento no es necesario, pero se realizó aquí únicamente para demostrar que el protocolo de superficie celular es específico para las proteínas de la superficie celular. También llevamos a cabo el protocolo estándar de etiquetado sin ETH ni dieta que se muestra a continuación: las células se lisan antes del etiquetado, y de este modo todas las proteínas celulares quedan accesibles para el etiquetado. Después del paso de etiquetado, las muestras se someten a electroforesis en dos dimensiones.

Las células adherentes se separan mediante un procedimiento no enzimático para evitar la digestión de las proteínas de superficie celular diana. En este protocolo, utilizamos el raspador de goma, aunque también es una opción usar medios de disociación celular enzimáticos. A continuación, se cuentan y dividen las suspensiones celulares en alícuotas de cinco a 10 millones de células por tubo. Luego, las células se centrifugan y se lavan con H-P-S-S-P-H 7.4 para eliminar restos de cultivo celular.

La contaminación del medio por proteínas séricas y componentes fluorescentes puede interferir con la marcación y detección. Las células en suspensión se centrifugan directamente y se lavan antes del paso de marcación tras el lavado. La suspensión celular se resuspende en 200 microlitros de tampón de marcación frío con hielo que contiene HPSS pH 8,5 y una molar urea.

Para condiciones óptimas de marcado de proteínas de superficie celular, verifique siempre el pH. Antes del marcado, utilizamos 600 picomol de side-eye por 10 millones de células CHO. La relación óptima de side-eye respecto al número de células variará según el tipo celular.

Dado que no conocemos las concentraciones exactas de proteínas en la superficie celular, en el manual de principios y métodos de electroforesis bidimensional se describe cómo determinar las condiciones óptimas para la marcación de proteínas con side eye. Las células se incuban con side eye D floor, dados mínimos durante 20 minutos en hielo y en la oscuridad.

Después de la reacción de marcado, el colorante no reactivo se inactiva mediante la adición de 20 microlitros de lisina 10 milimolar. Las células marcadas se lavan ahora dos veces con tampón HPSS frío a pH 7,4 para eliminar el exceso de colorante. Por lo tanto, no quedará colorante libre para un marcado intracelular no deseado ni para proteínas en el siguiente paso, que es la lisis celular.

Las proteínas en la superficie celular están ahora marcadas y las células se lavan y están listas para ser lisadas. El precipitado del último paso de lavado se resuspende en 150 microlitros de tampón de lisis frío que contiene siete moles de urea, dos moles de tiourea, 4 % de CHAPS, treinta milimoles de Tris, cinco milimoles de acetato de magnesio, pH 8,5, y se deja en hielo durante al menos una hora con vortexados ocasionales. Las muestras están ahora listas para la separación en 2D.

El primer paso en la electroforesis es preparar las tiras IPD para la rehidratación. Prepare la solución de rehidratación agregando tampón IPG correspondiente al intervalo de pH de las tiras utilizadas, y añada la solución en la lente de la bandeja de rehidratación. Retire la película protectora de la tira IPG y coloque cuidadosamente las tiras con el gel seco hacia abajo en la bandeja de rehidratación que contiene la solución de rehidratación.

Cierre la tapa del recipiente IPG y rehidrate las tiras durante la noche. En la primera dimensión, el enfoque isoeléctrico, las proteínas se separan según su pi. Esto se realiza utilizando el IPG four three.

Las tiras rehidratadas se colocan en el manifold y el electrodo se monta en la parte superior. Se aplicaron 50 microgramos de cada muestra utilizando tapones de aplicación de muestra. Hemos aplicado directamente muestras no fraccionadas sin fraccionamiento previo o fraccionado las muestras en fracciones membranales y citosólicas antes de su aplicación.

La tapa se cierra para proteger las muestras fluorescentes de la luz. El instrumento se programó según las recomendaciones y se ejecutó durante la noche. Se vertieron geles grandes al 12 % lamby utilizando el molde para geles adulto 12.

Se añadió una solución desplazante Coster para evitar geles de acrilato polimerizados en los tubos. Se dejó que los geles polimerizaran durante la noche a temperatura ambiente antes de su uso. Después de la electroenfoque isoeléctrico, se retiran las tiras y se equilibran en tampón que contiene SDS en dos pasos, utilizando DTT para reducir los enlaces disulfuro de los residuos de cisteína, seguido de alquilación con acetamida para evitar modificaciones por acrilamida.

Las tiras IPG se sumergen en tampón de corrida y se colocan cuidadosamente encima de los geles grandes de dos dimensiones. Evite atrapar aire entre las tiras y el gel sellando con una solución fundida de agarosa al 2 % con azul de bromofenol encima. Los geles ya están listos para la separación en la segunda dimensión mediante electroforesis SDS-PAGE. En la segunda dimensión SDS-PAGE.

Las proteínas se separarán según su peso molecular y esto se realiza con el sistema tonal seis. Llene la cámara de electroforesis con tampón de corrida anódico, inserte los geles y llene el compartimento superior con tampón de corrida catódico. Conecte la fuente de alimentación según las recomendaciones y realice la segunda dimensión protegida de la luz durante aproximadamente cuatro a cinco horas o hasta que el frente del colorante alcance la parte inferior del gel.

Después de la electroforesis en segunda dimensión, las cassettes de gel se colocan mediante pinzas en el revelador fluorescente Typhoon. Se pueden escanear dos geles y tres canales simultáneamente. Los resultados de este 2D-PAGE muestran una alta resolución de las proteínas de membrana en la muestra, incluso si existen algunas limitaciones conocidas para la detección de proteínas hidrofóbicas en un 2D-PAGE. Los resultados muestran muchos nuevos puntos etiquetados en la superficie celular, mostrados aquí en rojo, que no se detectan utilizando el protocolo de etiquetado estándar mostrado aquí en verde.

Estos resultados muestran que el protocolo de marcado en la superficie celular es altamente específico para marcar proteínas de la superficie celular. Dado que únicamente se marcan las proteínas de la superficie celular, estas se visualizan más fácilmente y se evita la atenuación causada por las proteínas citosólicas abundantes. La imagen fluorescente de geles con fracción de membrana no fraccionada o fracción citosólica se muestra en la parte superior.

A continuación se muestra una imagen del mismo gel teñido con plata. Los resultados no muestran etiquetado fluorescente de proteínas citosólicas, pero la tinción con plata indica que hay proteínas presentes en los geles. Los resultados también revelan patrones de mapas de puntos similares entre las fracciones no fraccionadas y las fracciones de membrana, lo que demuestra que no es necesario realizar una fraccionación previa a la electroforesis bidimensional, lo cual hace que este protocolo sea sencillo y práctico.

SI dos, SI tres y SCI cinco muestran patrones de etiquetado similares y son todos compatibles con el protocolo de superficie celular. Se realizó un experimento de dieta utilizando los tres tipos de medio mínimo de lado de ojo DI para estudiar la expresión diferencial de proteínas de superficie celular en células CHO sometidas a privación de suero durante diferentes periodos de tiempo. Las muestras de superficie celular CY dos de todas las muestras del experimento se agruparon y utilizaron como estándar interno.

Podrían seguirse los cambios diferenciales de varias proteínas de superficie celular durante el período de privación de nutrientes. Se detectaron más de 18 proteínas de membrana novedosas mediante el protocolo de superficie celular que no se detectaron con el protocolo estándar para determinar la identidad de las proteínas en el gel preparativo. Fue necesario agregar una muestra de superficie celular para facilitar la correspondencia con los puntos en el conjunto de datos analíticos.

Hay resultados. Los resultados muestran una alta resolución de un gran número de proteínas de la superficie celular. Este protocolo es muy específico para proteínas de la superficie celular y no se observó etiquetado de proteínas intracelulares.

Con este método, es posible detectar más proteínas de superficie celular en comparación con un protocolo estándar, y como ya ha visto, es un protocolo muy sencillo de realizar. Simplemente marque sus proteínas de superficie celular mientras aún están intactas y enrételas directamente en una electroforesis bidimensional sin fraccionar la membrana. Por lo tanto, este es un protocolo muy adecuado para estudiar las proteínas de superficie celular y las diferencias de estas con la tecnología D.