Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

El procedimiento comienza con la anestesia del ratón y la preparación del sitio quirúrgico. Luego, el ratón se coloca en posición prona sobre el instrumento estereotáxico. Se realiza una incisión sagital de la piel por debajo del occipucio y se separa por disección roma el tejido subcutáneo y los músculos del cuello a través de la línea media.

Luego, se coloca la parte posterior del cuerpo de forma que el cuerpo forme un ángulo de 135 grados con la cabeza fija, se penetra la duramadre del agujero occipital con la micropipeta de vidrio y se recoge el LCR. Después de la extracción del LCR, los músculos se reacomodan y la piel se sutura; se inyecta aproximadamente un mililitro de solución salina 0.9 %NACL subcutáneamente para prevenir la deshidratación y el ratón se mantiene caliente hasta que se recupere. Hola, mi nombre es Liu, del laboratorio de la Dra. Karen Duff en el Instituto Superior de la Universidad de Columbia.

Hoy les mostraré cómo recolectar líquido cefalorraquídeo del sistema mag del ratón. Con esta técnica, podemos obtener muestras seriadas de LCR hasta tres veces del mismo ratón, con intervalos de dos a tres meses. En nuestro laboratorio, utilizamos esta técnica para determinar los niveles de A beta o tau en LCR a diferentes edades en nuestros modelos transgénicos de ratón para la enfermedad de Alzheimer, y correlacionamos estos valores con los del cerebro.

Al final, estamos interesados en el potencial de los niveles de beta o tau de CSFA como marcadores biológicos potenciales para la progresión de la enfermedad y también para los ensayos terapéuticos en los ratones. Así que comencemos. Para este procedimiento, es necesario fabricar capilares con un micropipeteador polar.

Los capilares utilizados aquí son de vidrio silicato BOA B 175 10 de Sutter Instruments; se estiran los capilares en un micropipeteador con llama Sutter P 87 polar con el índice de calor ajustado a 300 y el índice de presión ajustado a tres 30. El capilar de vidrio tiene cinco centímetros de longitud y presenta una punta cónica. La punta del capilar se recorta con tijeras para que su diámetro interno sea de aproximadamente 0,5 milímetros.

El procedimiento quirúrgico comienza anestesiando al ratón con ketamina 100 miligramos por kilogramo y xilacina 10 miligramos por kilogramo administrados por vía intraperitoneal; durante la anestesia, mantenga al ratón calentado en un incubador a 37 grados Celsius. Después de determinar que el animal está completamente anestesiado mediante el reflejo de retirada al pellizcarle un dedo del pie, afeite el cuello y luego coloque al ratón en el instrumento estereotáxico, como este modelo de David Kink. En contacto directo con la alfombrilla calefactora, inserte una sonda de temperatura rectal para que el calor de la alfombrilla pueda ajustarse según la temperatura corporal del ratón.

Sujete la cabeza con los adaptadores para la cabeza, limpie la piel del cuello con yodo povidona al 10 % y etanol al 70 % tres veces y realice una incisión sagital por debajo de la porción posterior de la cabeza u occipucio. Los siguientes pasos deben realizarse bajo un microscopio de disección utilizando pinzas romas. Separe el tejido subcutáneo y los músculos M por ventor services y M rectus capita dorsalis major para exponer la duramadre del esternón magna. Utilice adecuadamente un par de retráctores microscópicos para mantener separados los músculos.

Finalmente, coloque al ratón con la cabeza en un ángulo de 135 grados respecto al cuerpo. El ratón ya está listo para la recolección de LCR. Esta técnica de recolección de LCR desde el agujero magno fue publicada previamente.

Figura C uno A bajo el microscopio de disección. La duramadre aparece como un triángulo invertido brillante y transparente a través del cual son visibles la médula oblonga y un vaso sanguíneo importante. Arteria dural spinella figura C uno B. Puede observarse la pulsación circulatoria de la médula y el espacio adyacente de LCR.

Seque la duramadre con un hisopo estéril, introduzca el capilar en el esternón CI a través de la duramadre, lateralmente a la arteria espinal dorsal. Habrá un cambio notable en la resistencia cuando el capilar se inserte correctamente y entonces el LCR fluirá hacia el interior del capilar. Una vez recolectado el LCR, retire cuidadosamente el capilar y conéctelo a una jeringa de tres mililitros utilizando un tubo de polietileno con un diámetro interno de un milímetro.

Inyecte el LCR en un tubo de 0,5 mililitros. Etiquete el tubo y congélelo inmediatamente en hielo seco. Una vez congelado, transfiera el LCR a un congelador a menos 80 grados Celsius.

La técnica de muestreo que acaba de demostrarse es extremadamente suave y permite obtener muestras subsecuentes de LCR del mismo ratón durante un intervalo de dos a tres meses. Por lo tanto, tras el muestreo, los músculos y la piel del cuello deben reubicarse y cerrarse con puntos de sutura. Después de suturar la incisión, inyecte aproximadamente un mililitro de solución salina al 0,9 %NACL por vía subcutánea para rehidratar al ratón.

Mantenga al ratón calentado a unos 37 grados Celsius hasta que se recupere. Monitoree su peso el día uno y el día siete después de la cirugía. Acabo de mostrarle cómo recolectar líquido cefalorraquídeo del sistema mag del ratón.

Al realizar este procedimiento, hay tres aspectos importantes que debe recordar. Primero, coloque adecuadamente la cabeza y el cuerpo del ratón sobre el marco estereotáxico para que el ator del Cy Magna pueda exponerse lo más posible. Segundo, evite cuidadosamente los vasos sanguíneos al penetrar el durómetro con la capilar.

De lo contrario, su muestra se contaminará con la sangre. Por último pero no menos importante, recuerde mantener calientes a sus ratones durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. La hipotermia no solo es perjudicial para sus ratones, sino que también puede afectar significativamente sus resultados al inducir una relación de producción beta o hipofosforilación tall.

Vale, eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.