Article de recherche
Le gating polygonal (PGG) et le gating cruciforme (CFG) sont des méthodes de cytométrie en flux permettant de détecter l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes. Le PGG mesure l’indice de fragmentation de l’ADN (DFI) et l’indice élevé de coloration de l’ADN (HDS). Le CFG rapporte un DFI sévère, un DFI léger et un DFI global. Cette étude vise à comparer les résultats et les corrélations entre eux.
L’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes est un facteur clé pour assurer la fécondation réussie, le développement embryonnaire et la poursuite de la grossesse. L’évaluation de la structure de la chromatine spermatique (SCSA) utilisant la cytométrie en flux après dénaturation de l’ADN et la coloration à l’acridine orange est considérée comme la méthode de référence pour évaluer l’ADN des spermatozoïdes. Deux stratégies de filtrage pour l’évaluation de l’indice de fragmentation de l’ADN (DFI) basées sur la cytométrie en flux ont été rapportées dans la littérature : la porte polygonale (PGG) et la porte cruciforme (CFG). L’objectif de la présente étude était de comparer les relations des résultats des tests entre PGG et CFG, et d’analyser leurs corrélations avec les paramètres de l’analyse de sperme de base. Les données obtenues indépendamment par les deux méthodes ont été comparées à l’aide d’analyses statistiques, incluant les graphiques de Bland-Altman et l’analyse de régression. Un total de 121 patients masculins externes faisant l’objet d’une évaluation de leur fertilité au centre reproductif de notre hôpital ont été sélectionnés par une méthode d’échantillonnage totalement aléatoire. Les IFF des spermatozoïdes et les indicateurs associés ont été détectés par cytométrie en flux utilisant respectivement PGG et CFG. Les résultats ont démontré que les valeurs DFI obtenues à partir des deux méthodes montraient une bonne concordance. Les coefficients de corrélation entre DFIp de la méthode PGG et DFIm, DFIs et DFIc de la méthode CFG étaient respectivement 0,6497, 0,9404 et 0,9667 (tous p < 0,01). Un indice élevé de coloration ADN (HDS) a montré une légère corrélation négative avec les IFD (r = -0,3042, p < 0,05). Le pourcentage de spermatozoïdes progressivement mobiles était négativement corrélé avec DFIp, DFIs et DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivement, tous p < 0,05). Aucune corrélation significative n’a été observée entre la HDS et le volume de sperme, la concentration de spermatozoïdes, le nombre total de spermatozoïdes ou la PR ( %). Ces résultats indiquent que les IFD sont plus étroitement associés à la fertilité masculine, ce qui suggère que la méthode CFG, qui fournit ce paramètre, pourrait être plus adaptée à l’évaluation clinique des dommages à l’ADN spermatozoïde.
L’intégrité de l’ADN du spermatozoïde fait référence à l’intégrité et à la stabilité fonctionnelle de la structure moléculaire de l’ADN dans le noyau du spermatozoïde. Plus précisément, elle se caractérise par une conformation normale de la chromatine, des séquences de base intactes sans rupture ni dommage oxydatif, et la capacité à transmettre avec précision l’information génétique à la descendance. Lors de la spermatogenèse, lorsque le stress oxydatifaugmente 1, que le remodelage de la chromatine estanormal 2, ou que le spermatozoïde est affecté par des toxinesenvironnementales 3, l’intégrité de l’ADN spermatique sera endommagée, entraînant un décalage de bases, une perte, une modification, un ajout et une réticulation d’ADN, des ruptures simple et double brin, etc. De plus, l’ADN des spermatozoïdes endommagé peut altuer la fertilité masculine et affecter négativement les résultats de la grossesse dans la technologie de procréation assistée (ART)4, tout en augmentant le risque de perte de grossesserécurrente 5. En 2021, l’Association européenne d’urologie (EAU) a recommandé l’inclusion des tests DFI dans le système d’évaluation de la fertilitémasculine 6.
Actuellement, l’intégrité de l’ADN du spermatozoïde est principalement évaluée en détectant l’indice de fragmentation de l’ADN du spermatozoïde (DFI). Le test de structure de la chromatine spermatique (SCSA) par cytométrie en flux est la méthode principale pour évaluerDFI 7. Deux méthodes de contrôle par cytométrie en flux pour la détection des DFI chez les spermatozoïdes ont été rapportées dans la littérature. L’un d’eux est la méthode de contrôle polygonal (PGG), qui peut rapporter simultanément deux indicateurs clés, tels que le DFI des spermatozoïdes et leHDS 8. PGG est une approche classique de la SCSA caractérisée par un coefficient de variation de détection plus faible et une répétabilité supérieure9. Cependant, il ne peut pas distinguer la gravité des dommages à l’ADN. Un autre type est la méthode de gating cruciforme (CFG), qui peut rapporter un marqueur de dommage sévère de l’ADN spermatique (DFI), un marqueur de dommage léger de l’ADN spermatique (DFIm), ainsi que le DFI total de la méthode de gating cruciforme (DFIc). DFIc est égal à la somme des DFIs et des DFIm. Comparée aux technologies actuelles d’évaluation de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes, la méthode CFG peut refléter la gravité des dommages à l’ADN desspermatozoïdes 10.
Pour déterminer quelle méthode est la plus adaptée à l’évaluation de la qualité des spermatozoïdes, cette étude a utilisé à la fois la méthode PGG et la méthode CFG pour mesurer les DFI et les paramètres associés chez les spermatozoïdes. La corrélation entre les résultats de ces deux méthodes et les paramètres conventionnels d’analyse du sperme a été comparée. À notre connaissance, il s’agit de la première étude à analyser la corrélation des résultats de détection entre les deux méthodologies, PGG et CFG.
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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’Hôpital Premier Peuple Huai’an affilié de l’Université médicale de Nankin (Numéro d’approbation : KY-2024-181-01). Un consentement éclairé a été obtenu auprès des patients dont les échantillons ont été utilisés dans cette étude. Schéma global du flux de travail présenté à la Figure 1. Les détails des réactifs et équipements utilisés sont décrits dans le tableau des matériaux.
Réglages de la CFG pour le cytomètre en débit
Après un traitement acide, la chromatine nucléaire des spermatozoïdes avec l’ADN endommagé présente de l’ADN simple brin, tandis que la chromatine nucléaire des spermatozoïdes à ADN intact conserve sa structure bibrinque intacte. Le colorant fluorescent acridine orange (AO) se lie à l’ADN simple brin et émet une fluorescence rouge lorsqu’il est excité par un laser de 488 nm. Lorsqu’elle est liée à de l’ADN double brin, elle émet une fluorescence verte lorsqu’elle est excitée par un laser de 488 nm. En fonction du nombre de signaux fluorescents rouges et verts captés par le cytomètre en flux, le rapport de la fluorescence rouge au total de la fluorescence rouge et verte est calculé, ce qui représente le DFI du spermatozoïde.
Les réglages CFG ont été mis en œuvre selon l’aperçu fourni par Yang et al.10. Le cytomètre en flux doit être configuré en utilisant la fluorescence verte la plus basse et la fluorescence rouge la plus élevée mesurée dans des spermatozoïdes normaux colorés en O comme références aux limites (Figure 2). Voici une liste des caractéristiques cellulaires de chaque quadrant du CFG :
Le quadrant Q1 indique un spermatozoïde normal. Il a été observé que l’ADN du spermatozoïde était intact et que la quantité de liaison d’AO était minime, ce qui a entraîné une fluorescence verte.
Les spermatozoïdes du quadrant Q2 ont un ADN partiellement fragmenté et apparaissent orange sous microscopie à fluorescence. Un tel ADN peut être réparable, ces spermatozoïdes sont classés comme ayant une fragmentation légère de l’ADN (DFIm)10.
Le quadrant Q3 est défini comme la fluorescence non spécifique qui a subi une soustraction.
Les spermatozoïdes du quadrant Q4 ont de l’ADN fragmenté et apparaissent rouges sous microscopie à fluorescence, indiquant une fragmentation sévère de l’ADN (DFI).
Il est proposé que les spermatozoïdes des quadrants Q2 et Q4 contiennent tous deux de l’ADN fragmenté, et que leur somme est définie comme DFIc.
Réglages du PGG pour le cytomètre à flux
La porte polygonale pour l’analyse cytométrique en flux a été établie selon la méthode décrite par Evenson et al.8. Comme montré à la Figure 3, les caractéristiques cellulaires associées à chaque grille sont les suivantes :
P3 indique le pourcentage de cellules avec de l’ADN dénaturé.
P4 représente les spermatozoïdes à haute colorabilité de l’ADN (HDS). Ce groupe de spermatozoïdes ne présente pas l’échange normal entre histones et protaminiques.
Les populations cellulaires prédominantes situées en dehors des portes P3 et P4 sont composées de spermatozoïdes normaux, présentant une fluorescence rouge réduite et émettant principalement une fluorescence verte.
Collecte et analyse des échantillons de sperme
Les 121 échantillons de sperme provenaient tous des hommes ayant visité le Centre de Reproduction du Premier Hôpital de Huai’an affilié à l’Université médicale de Nankin. Des échantillons de sperme ont été prélevés en se masturbant après une période de 2 à 7 jours d’abstinence. L’analyse de sperme de routine a été strictement réalisée conformément aux exigences du Manuel de laboratoire de l’OMS pour l’examen et le traitement du sperme humain11,12. Les analyses de concentration et de motilité des spermatozoïdes ont été réalisées à l’aide d’un système d’analyse assistée par ordinateur (CASA). Chaque échantillon a été analysé deux fois. Les résultats n’étaient rapportés comme moyenne que lorsque la différence entre les deux résultats se situait dans l’intervalle de confiance de 95 % ; sinon, des rééchantillonnages et des analyses ont été réalisés.
Analyse des IFD
Calculez le volume d’échantillon requis pour l’échantillon de sperme afin que la concentration finale de spermatozoïdes dans le réactif A du kit de cytométrie en flux soit de 2 à 3 x10 6/mL. Méthode de calcul : En supposant que la concentration de sperme dans l’échantillon de sperme original soit M x 106/mL, alors le volume de sperme requis (μL) = 150/M. Ajoutez le volume de sperme calculé dans un tube cytomètre à débit, puis ajoutez 50 μL de réactif A et mélangez doucement. Ajoutez 100 μL de réactif B, mélangez doucement, puis éclovez pendant 30 s à température ambiante. Ajoutez immédiatement 300 μL de réactif C et mélangez doucement. Détectez l’échantillon à l’aide de CFG et PGG sur le cytomètre en flux, et analysez au moins 5000 spermatozoïdes.
Analyse statistique
Les données ont été soumises à une analyse statistique à l’aide de GraphPad Prism 6.0. Des graphiques de Bland-Altman ont été construits pour évaluer le niveau d’accord entre PGG et CFG en calculant la moyenne et les différences. Les différences entre les deux méthodes ont été tracées par rapport à leurs valeurs moyennes. De plus, la méthode Pearson a été utilisée pour analyser la corrélation entre PGG et CFG. Il a été déterminé qu’une valeur p inférieure à 0,05 était statistiquement significative.
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Parmi les 121 participants à l’étude (moyenne d’âge : 32,5 ± 4,9 ans ; plage : 26–44 ans), 28 ont été diagnostiqués avec une asthénozoospermie et 4 avec une oligozoospermie. Les caractéristiques démographiques de base et les paramètres d’analyse du sperme sont résumés dans le tableau 1.
Comme démontré dans la Figure 4, le graphique de Bland-Altman a révélé que les résultats DFI des spermatozoïdes obtenus par les m...
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La 6e édition du Manuel de laboratoire de l’OMS pour l’examen et le traitement du spermehumain 12 recommande quatre méthodes pour évaluer l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes : le marquage terminal par déoxynucléotyl transférase (dUTP) par pointage (TUNEL), les tests d’électrophorèse en gel unicellulaire (Comet), le SCSA, et le test de dispersion de la chromatine spermatique (SCD). Parmi ceux-ci, le SCSA a été largement adopté dans les laboratoires d’andrologie...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système d'analyse de sperme assisté par ordinateur | Beijing Suijia Software Co., Ltd | SA-II | |
| Cytomètre en flux | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Cyto E6 | |
| Kit de cytométrie en flux | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | ||
| Chambre de dénombrement Makler | Sefi Medical Instruments | ||
| Kit d'intégrité de l'ADN du noyau spermatique | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | - |
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