Une plateforme d’électroporation microfluidique numérique pour l’édition génomique CRISPR à faible entrée et la transfection d’ARNm dans des cellules T en suspension et des modèles de cellules 3D

Résumé

Ce protocole décrit l’édition miniaturisée du génome CRISPR–Cas9 du récepteur TCRα/β dans les lymphocytes T humains primaires à l’aide de la « DMF-ection », une plateforme d’électroporation microfluidique numérique (DMF). La méthode permet une édition génétique parallèle, à faible entrée et avec une viabilité élevée, et est également adaptable pour la délivrance d’ARNm dans des sphéroïdes 3D multicellulaires.

Résumé

L’électroporation microfluidique numérique (DMF) permet une manipulation génétique précise et à faible volume des cellules de mammifères tout en minimisant l’apport cellulaire jusqu’à 100 fois et en préservant la viabilité. Cette étude présente un flux de travail de transfection à haut débit basé sur DMF pour l’élimination médiée par CRISPR du locus TRAC dans les lymphocytes T en suspension humaine primaire et pour la transfection d’ARNm de sphéroïdes HEK293T tridimensionnels. Grâce à des ARN guides CRISPR déposés spatialement et à l’assemblage de ribonucléoprotéines (RNP) sur cartouche, une perturbation efficace du locus TRAC a été obtenue dans les populations de lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ en utilisant seulement 10 000 cellules par condition, avec des viabilités post-édition dépassant 85 %. La caractérisation biophysique utilisant des analyses induites par flux et dispersion de Taylor a révélé que les additifs polymères stabilisent les complexes Cas9–sgRNA dans des conditions de tampon d’électroporation, permettant un montage reproductible à des volumes submicrolitres. Le flux de travail a été adapté aux applications 3D en délivrant de l’ARNm d’EGFP dans des sphéroïdes HEK293T intacts, ce qui a permis une fluorescence robuste et spatialement uniforme sans nuire à la croissance ou à la morphologie des sphéroïdes. Ensemble, ces résultats démontrent que l’électroporation du DMF permet une édition efficace du génome et la délivrance d’ARNm à travers les cellules immunitaires en suspension et les sphéroïdes multicellulaires. Cette plateforme offre une solution évolutive et à faible consommation d’entrées pour des applications en thérapie par cellules CAR-T, génomique fonctionnelle et modèles cellulaires 3D avancés.

Introduction

L’édition génétique dans les cellules humaines primaires est de plus en plus centrale tant dans le développement thérapeutique que dans la recherche fondamentale, y compris dans les applications en immuno-ingénierie, modélisation des maladies rares et génomique^{fonctionnelle.} Bien que l’électroporation permette une édition génomique très efficace, les systèmes conventionnels basés sur des cuvettes nécessitent généralement jusqu’à des millions de cellules par condition, limitant leur utilisation pour les échantillons dérivés du patient et les populations immunitaires^{rares 2}. De plus, ces systèmes sont peu adaptés au criblage à grande échelle en raison des limitations de débit, d’automatisation et de consommation de^{réactifs 3}.

L’électroporation microfluidique est apparue comme une approche prometteuse pour l’édition génomique à faible entrée⁴. Cependant, la plupart des plateformes existantes reposent sur des architectures à flux continu impliquant une manipulation complexe des fluides, une flexibilité limitée dans le mélange des réactifs et des exigences relativement élevées en cellules par condition. En revanche, la microfluidique numérique (DMF) permet la manipulation active de gouttelettes discrètes à l’échelle du nanolitres sur un réseau d’électrodes planes, permettant un contrôle précis de la composition de la réaction, du timing et de la localisation spatiale. Ce format plug-and-play basé sur des gouttelettes convient parfaitement aux flux de travail à faible volume et à haut débit où la conservation des cellules primaires et des réactifs est^{essentielle 5}.

Des travaux récents ont démontré la faisabilité de la livraison intracellulaire basée sur le DMF en utilisant des architectures d’électroporation tri-gouttelettes qui génèrent des champs électriques localisés à faible courant pour une livraison efficace de RNP et d’ARNm tout en minimisant les contraintes thermiques et électrochimiques ^6,7,8. S’appuyant sur cette base, une plateforme d’électroporation DMF de nouvelle génération, appelée « DMF-ection », comprenant 48 sites de réaction adressables de façon indépendante, une compatibilité complète en automatisation et une fabrication de cartouches^{évolutive 9} (Figure 1) a été développée. La cartouche DMF se compose d’une plaque PCB inférieure et d’une plaque supérieure en plastique séparées par un joint, assemblées par des boutons d’alignement dans une seule orientation correcte (Figure 1A). La disposition 48-plex est organisée en huit familles identiques (Figure 1A–H), chacune contenant six sites d’électroporation adressables indépendamment, supportant jusqu’à 48 conditions d’édition parallèle par cartouche (Figure 1B). Les bibliothèques d’ARN guides sont déposées sur la surface du substrat à l’aide d’un distributeur acoustique avant l’assemblage de la cartouche. La précision positionnelle du dépôt a été confirmée sur les 48 sites, avec des positions de chute se regroupant dans une déviation submillimétrique par rapport au point médian de l’électrode (Figure 1C), soutenant un assemblage RNP fiable sur la cartouche. Après chargement, les cellules et les gouttelettes d’électrodes liquides sont actionnées sur la cartouche pour former la géométrie d’électroporation tri-gouttelettes (Figure 1D). Après l’électroporation, les cellules sont déchargées dans des plaques de culture pour la récupération et l’analyse en aval, incluant la cytométrie en flux, le séquençage et la microscopie (Figure 1E). Ce système permet une édition génomique à haute efficacité en utilisant jusqu’à 100 fois moins de cellules que les méthodes standard basées sur des cuvettes, élargissant considérablement l’accès à l’ingénierie génomique dans les applications à faible entrée et à haut débit.

Cette étude évalue les performances de la plateforme en livrant plusieurs cargaisons biomoléculaires, y compris des complexes d’ARNm et de ribonucléoprotéines (RNP) CRISPR–Cas9, assurant ainsi une transfection efficace et une perturbation génique. En plus des lymphocytes T primaires, la DMF-ection fournit un cadre généralisable pour délivrer des acides nucléiques dans des structures multicellulaires complexes. Les sphéroïdes tridimensionnels (3D) et les modèles organoïdes imposent des barrières importantes à la pénétration des réactifs en raison de leur architecture et de leur fragilité, et les approches conventionnelles d’électroporation perturbent souvent la morphologie ou génèrent une livraison hétérogène. Pour évaluer si les mêmes principes miniaturisés d’électroporation utilisés pour l’édition des lymphocytes T s’étendent aux tissus structurés, le flux de travail DMF a été appliqué aux sphéroïdes HEK293T 3D. Ces expériences ont démontré que l’électromouillage à base de DMF peut positionner doucement les sphéroïdes intacts dans les géométries à trois gouttelettes et soutenir une livraison uniforme de l’ARNm tout en préservant la structure et la croissance. Bien que ces résultats soient en dehors du protocole principal des lymphocytes T décrit ici, ils illustrent l’applicabilité plus large de l’électroporation programmable DMF pour les systèmes cellulaires 3D émergents pertinents pour la découverte de médicaments et la modélisation des maladies.

Protocole

Les lymphocytes T humains primaires utilisés dans ce protocole ont été obtenus auprès de fournisseurs commerciaux sous le consentement éclairé du donneur et conformément aux directives institutionnelles, éthiques et réglementaires applicables. Toute la manipulation des matériaux biologiques d’origine humaine a été réalisée conformément aux protocoles de biosécurité institutionnels. Les chercheurs mettant en œuvre ce protocole sont responsables de s’assurer que leur utilisation des cellules humaines primaires respecte les exigences du comité d’éthique ou du comité d’éthique local, les réglementations applicables sur la biosécurité, ainsi que toute législation nationale ou régionale pertinente régissant l’utilisation du matériel biologique humain. Aucune information identifiable par le patient n’a été associée au matériel cellulaire utilisé dans cette étude.

1. Préparation et activation des lymphocytes T humains primaires

1. La décongélation a rapidement présauvé les cellules T CD3⁺ humaines primaires dans un bain-marie à 37 °C. Transférez les cellules dans un milieu basal préchauffé pour cellules T et centrifugez à 180 × g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu frais.
2. Déterminez la concentration et la viabilité cellulaires à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
3. Resuspendre les cellules à 1 × 10⁶ cellules/mL dans un milieu de culture de lymphocytes T complété par un stimulus activateur des lymphocytes T CD3/CD28 (selon les instructions du fournisseur) et 200 UI/mL d’IL-2. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Maintenir la densité cellulaire entre 0,5 et 2 × 10⁶ cellules/mL pendant l’activation. Effectuer l’activation dans des plaques à 96 puits U-bottom afin d’optimiser l’efficacité du contact cellule-activateur et de l’activation.

2. Préparation des taches d’ARN guide sur le substrat DMF (spotting par distributeur acoustique)

1. Reconstituer l’ARNsg lyophilisé dans de l’eau sans nucléase à une concentration de stock de 100 μM. Dans un tube séparé, préparez un stock de 100 mg/mL d’acide poly-L-glutamique (PGA, sel de sodium, MW 15 000–50 000 Da) dans de l’eau sans nucléase. Combinez le stock de sgRNA et PGA à un rapport volumique de 5:4 (sgRNA : PGA) qui donne une concentration finale de sgRNA de 55,6 pmol/μL et une concentration finale de PGA de 44,4 mg/mL dans de l’eau sans nucléase. Vortex brièvement et centrifugeuse à 1 000 × g pendant 30 s et aliquotes en volumes à usage unique, et stocke les aliquotes inutilisées à −80 °C pendant jusqu’à 6 mois.
   REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
2. Ajouter le mélange guide-PGA à une plaque acoustique à faible volume mort dans des puits correspondant à la disposition souhaitée du site de réaction.
3. Transférez 40 nL (équivalent à 2,2 pmol sgRNA) du mélange guide-PGA à chaque région de spotting cible du substrat DMF à l’aide d’un distributeur acoustique calibré.
   REMARQUE : À 55,6 pmol/μL, 40 nL délivre 2,2 pmol d’ARNsgRNA par site (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Les guides séchés sont reconstitués lors de la fusion des gouttelettes sur la cartouche ; La resuspension complète est confirmée par une efficacité de montage constante sur plusieurs sites.
4. Dans un cabinet de sécurité biologique, laissez les gouttelettes tachetées sécher complètement à l’air à température ambiante jusqu’à ce qu’il ne reste plus de liquide visible (environ 5 minutes).
   REMARQUE : N’utilisez pas de flux d’air forcé ni de chaleur, car cela pourrait déloger ou dégrader l’ARN guide.
5. Assemblez la cartouche DMF.
   1. Dans une armoire de sécurité biologique, alignez la plaque supérieure sur le substrat tacheté en faisant correspondre les éléments asymétriques de fermeture en plastique de la plaque supérieure avec les encoches sur la plaque inférieure. Appliquez une pression uniforme et simultanée le long des bords courts jusqu’à ce qu’un claquement mécanique distinct soit ressenti, confirmant l’engagement complet des blocages.
      REMARQUE : La cartouche est conçue avec une seule orientation correcte ; un assemblage incorrect ne produira pas le snap. Maintenez les substrats par les bords en permanence pour éviter toute contamination ou endommagement des surfaces fonctionnelles et évitez que les substrats ne glissent les uns contre les autres, car cela pourrait rayer les revêtements de surface.
   2. Point de contrôle : Confirmez l’assemblage correct par le clic mécanique.
      REMARQUE : Il n’existe pas d’indicateur électrique pré-run de l’intégrité du revêtement ; toute défaillance fonctionnelle résultant d’un assemblage incorrect est détectée automatiquement et rapportée dans le rapport QC post-exécution.
      Point de pause : Conservez les cartouches assemblées inutilisées dans un emballage scellé avec un dessiccant (sachets de gel de silice) à température ambiante pendant jusqu’à 48 heures.

3. Préparation des cellules

1. Préparez 1 mL de tampon de transfection complet avant chaque utilisation en combinant un tampon d’électroporation compatible DMF avec le tensioactif biocompatible non ionique fourni à un rapport 20:1 (v/v) (tampon d’électroporation : tensioactif), obtenant une concentration finale de tensioactif de 0,05 % (v/v). Mélangez doucement et laissez sur la glace.
   REMARQUE : Le tampon de transfection compatible DMF utilisé ici est un tampon isotonique à faible conductivité (conductivité : 3,5 mS/cm, osmolalité : 305 mOsm/L). Les chercheurs utilisant des tampons alternatifs devraient vérifier la compatibilité avec l’activation du DMF et la viabilité cellulaire. Le tensioactif non ionique biocompatible sert à réduire l’épinglement des gouttelettes ; si le tensioactif fourni n’est pas utilisé, un substitut approprié.
2. Laver les lymphocytes T activés une fois avec un tampon de transfection (sans tensioactif). Centrifugez à 180 × g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans un tampon de transfection complète (contenant du tensioactif) à 1,0 × 10⁷ cellules/mL dans un volume total de 100 μL par cartouche. Reste sur la glace.
3. Juste avant de charger sur la cartouche, ajouter directement la nucléase Cas9 aux 100 μL de suspension des lymphocytes T et mélanger par pipetage doux ; Reste sur la glace.
   REMARQUE : Pour les cellules T primaires, Cas9 est chargé à 42 pmol par volume de cartouche de 100 μL (0,42 pmol/μL). Chaque site d’électroporation traite environ 1 μL de suspension cellulaire, délivrant 0,42 pmol Cas9 par montage. Optimisez cette dose lors de l’adaptation à d’autres types de cellules immunitaires (voir Tableau 1).

Composant	Concentration finale par édition
Cas9	0,42 pmol dans ~1 μL de gouttelette
sgRNA	2,1 pmol (depuis le poste de 40 nL)
PGA	44,4 mg/mL de bouillon dans un mélange de taches
Tensioactif	0,05 % (v/v)
Entrée cellule	~10 000 cellules

Tableau 1 : Tableau sommaire des concentrations finales dans chaque gouttelette de transfection.

4. Transfection sur la plateforme DMF-ection

1. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 10 μL du mélange T-cell/Cas9 dans chacun des 8 ports de chargement des cellules, et 10 μL de tampon de transfection complet dans les 16 ports de charge d’électrodes liquides (comme illustré à la Figure 1).
2. Réglez la tension à 500 V, la durée de l’impulsion à 3 ms, et le nombre d’impulsions à 2. Initiez la séquence d’électroporation selon les instructions de la plateforme.
   1. Point de contrôle : Révisez le rapport de contrôle qualité post-course immédiatement après la course. Les défaillances sporadiques (<10 % des sites) ne nécessitent aucune intervention. Si les pannes sont systématiques, remplacez la cartouche par la carte QC fournie, effectuez le contrôle de santé système (~2 min) et contactez le support technique si les problèmes persistent.

5. Déchargement et récupération des lymphocytes T modifiées

1. À l’aide d’un manipulateur de liquides, transférez les cellules électroporées de chaque site de réaction dans une plaque U-bottom de 96 puits contenant 150 μL de milieu basal préchauffé pour cellules T complétées par 200 IU/mL d’IL-2.
2. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂ pour permettre le renouvellement des protéines et les changements d’expression des récepteurs à la surface.

6. Analyse par cytométrie en flux du knockout TRAC

1. Transférez les cellules vers une plaque inférieure conique stérile à 96 puits pour réduire la perte cellulaire entre les lavages. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de cytométrie en flux (1× PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) en centrifugant à 400 × g pendant 5 minutes et en retirant le surnageant en inversant doucement la plaque inférieure conique. Les cellules restent en granule dans la plaque.
2. Préparez un mélange maître de coloration de surface contenant des anticorps anti-CD4, anti-CD8 et anti-TCRα/β dans un tampon de cytométrie en flux aux concentrations recommandées par le fabricant. Ajoutez 25 μL de mélange maître par puits et faites éclore pendant 20 minutes à 4 °C protégé de la lumière. Lavez deux fois avec 1× PBS (sans FBS) en centrifugeant à 400 × g pendant 5 minutes. Resuspendez les cellules dans 100 μL de 1× PBS contenant un colorant de viabilité à 1:1 000 (v/v) et incubez pendant 10 minutes à température ambiante protégée de la lumière.
   REMARQUE : Les plaques coniques inférieures sont efficaces pour pelleter les cellules ; Vérifiez que les cellules sont bien resuspendues à toutes les étapes.
3. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de cytométrie en flux et resuspendez dans 150 à 200 μL par échantillon pour l’acquisition.
4. Configurez le cytomètre avec des lignes laser appropriées et des ensembles de filtres pour les fluorochromes utilisés (par exemple, excitation à 488 nm pour le colorant de viabilité ; 405 nm ou 488 nm pour les marqueurs de surface selon le cas). Régler les tensions à l’aide de contrôles de compensation à une seule teinture et d’un échantillon non coloré. Collectez un minimum de 5 000 événements en direct de singlets par échantillon. Porte séquentielle sur : singlets de diffusion → cellules vivantes (colorant de viabilité négatif) → expression de TCRα/β CD4⁺ ou CD8⁺ →.
   REMARQUE : Dans des conditions standard, le total des événements réels acquis peut varier de 5 000 à plus de 10 000 par échantillon après des pertes lors du lavage et de la coloration, étant donné que les cellules ont eu le temps de proliférer.
5. Déterminer la perturbation du gène TRAC en mesurant la fréquence des cellules TCRα/β-négatives dans les populations CD4⁺ et CD8⁺. Indiquez l’efficacité du knockout en pourcentage de cellules TCRα/β-négatives par rapport à la porte singlet vivante pour chaque sous-ensemble.

Résultats

Résultats attendus
L’électroporation de 10 000 lymphocytes T activés par condition aboutit généralement à une efficacité de knockout TRAC de >85 % avec une viabilité de >95 % 72 h après la transfection. La cytométrie en flux révèle une perte nette de coloration TCRα/β dans la condition de ciblage TRAC par rapport aux contrôles sgARN non ciblants (NTC) et aux contrôles non exposés à des champs électriques. Sauf indication contraire, n représente des exécutions...

Discussion

Ce protocole décrit un flux de travail miniaturisé d’électroporation microfluidique numérique qui permet une livraison intracellulaire efficace dans les lymphocytes T humains primaires à l’aide de gouttelettes à l’échelle nanolitre. Un avantage central de cette méthode est la capacité à réaliser l’édition du génome CRISPR–Cas9 en utilisant seulement 10 000 cellules par réaction, réduisant considérablement les besoins en matière par rapport à l’électroporation conventionnelle. L’architect...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol