Un algorithme d’analyse de forme quantifie la morphologie spatiale et le contexte de la culture cellulaire 2D à 3D pour une quantification novatrice des phénotypes

Résumé

Cet article explique comment de nouvelles caractéristiques morphologiques dans les cellules et les organoïdes peuvent être quantifiées à l’aide de la transformée polaire comprimée linéarisée (LCPC), un algorithme spatial qui capture des propriétés que les métriques traditionnelles, telles que la surface, le volume et la surface, ne peuvent pas. Les meilleures pratiques pour l’orientation et l’alignement des formes sont discutées.

Résumé

De nombreuses études ont montré que le phénotype morphologique d’une cellule ou d’un organoïde est corrélé à sa susceptibilité aux agents anticancéreux. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure du phénotype reposent sur des métriques spatiales telles que la surface, le volume, le périmètre et l’intensité du signal, qui fonctionnent mais sont limitées. Ces approches ne peuvent pas mesurer de nombreuses caractéristiques cruciales du contexte spatial, telles que la chiralité, une propriété de la gauchère et de la droitière. Le volume ne peut pas être utilisé pour enregistrer la chiralité car les chaussures gauche et droite ont le même volume. Bien que le contexte spatial sous forme de chiralité, de direction gravitationnelle et d’axe de polarité soit intuitif pour l’humain, les métriques traditionnelles utilisées jusqu’à présent par les biologistes cellulaires, pathologistes, radiologistes et praticiens de l’apprentissage automatique ne peuvent pas saisir ces notions fondamentales. La transformée polaire comprimée linéarisée (LCPC) est un algorithme novateur capable de capturer un contexte spatial comme aucune autre métrique. La transformée LCPC traduit un contour bidimensionnel (2D) en une onde sinusoïdale discrète en superposant un système de grille qui suit les points d’intersection entre le contour et les lignes de la grille. Elle transforme le contour en une suite de paires de coordonnées discrètes, la coordonnée indépendante (coordonnée x) correspondant à des positions consécutives dans l’espace 2D. Chaque coordonnée dépendante (coordonnée y) consiste en la distance entre une intersection entre le contour et la ligne de grille jusqu’à l’origine ou la ligne de base du système de grille. Sous la forme d’une onde sinusoïde discrète, la transformée rapide de Fourier est ensuite appliquée aux données. Ainsi, les formes des cellules en culture cellulaire 2D et 3D sont représentées de manière systématique et multidimensionnelle, permettant une stratification quantitative robuste qui révélera des informations sur la résistance au traitement.

Introduction

La culture organoïde tridimensionnelle (3D) s’est avérée supérieure à la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) en imitant la biologie in ^{vivo 1,2}. Les organoïdes sont devenus indispensables dans la recherche sur le cancer pour le dépistage de traitements efficaces et pour obtenir des informations sur la progression de la maladie 3,4,5,6. Bien qu’il soit bien connu en biologie du cancer que les distinctions morphologiques corrèlent avec un comportement biologique distinct des cellules et des tissus, ce domaine repose sur des métriques de forme traditionnelles qui sont limitées en portée. Cette étude décrit un nouvel algorithme spatial qui quantifie objectivement des caractéristiques morphologiques subtiles avec une précision sans précédent, surpassant les approches traditionnelles telles que la surface, le volume et la surface.

La transformée des coordonnées polaires comprimées linéarisées (LCPC) a été inventée pour décrire objectivement et quantitativement des morphologies complexes observées en histopathologie tissulaire, dans le but d’améliorer le gradage des polypes^{du côlon 7}. Le désir d’élargir ensuite cette approche pour capturer les caractéristiques spatiales basées sur l’IRM macroscopique dans les pathologies cérébrales, telles que le trouble bipolaire et la maladie d’Alzheimer, a conduit à des augmentations qui l’ont encore renforcée. Cette étude décrit le protocole étape par étape et les meilleures pratiques pour appliquer deux versions de la transformée LCPC : le système à grille parallèle et le système à grille radiale, qui disposent tous deux de scripts open source et de vidéos tutoriels.

Outre les méthodes géométriques traditionnelles, il existe plusieurs abstractions qui ont été efficaces pour mesurer les formes complexes des cellules et des organes. Cela inclut la mesure de l’excentricité, de l’asie, du contraste et de la kurtose, ainsi que des moments de Zernike pour capturer la circularité, l’asymétrie, l’irrégularité des arêtes et la structure globale^{des contours 8,9,10}. L’analyse fractale a également été utile pour réduire des contours complexes en valeurs scalaires, telles que la dimension fractale, qui mesure l’irrégularité du contour, et la lacunarité, qui mesure à quel point les espaces apparaissent hétérogènement irréguliers dans le contour^11,12. Pour mesurer la texture, la méthode de la matrice de cooccurrence des niveaux de gris (GLCM) est populaire pour mesurer le contraste, l’énergie, l’homogénéité, la corrélation et^{l’entropie 13,14}. Bien que toutes ces méthodes soient bénéfiques, aucune n’a été conçue pour capturer le contexte spatial, tel que la direction de la gravité, la position gauche ou droitière, ou la position de la structure centrale de soutien qui influence la direction du changement de forme. De plus, beaucoup d’entre eux produisent une seule valeur scalaire ou seulement quelques valeurs scalaires pour représenter des informations spatiales, c’est pourquoi les études citées les utilisent souvent en combinaison pour évaluer des formes complexes.

La transformée LCPC a été conçue pour produire de nombreuses caractéristiques à partir d’une seule mesure et permettre l’ajout de marqueurs spatiaux qui codent le contexte spatial dans la forme, comme la direction de gravité. La méthode la plus proche de la transformée^{LCPC 7} a été publiée un an après¹⁵, partageant la même idée centrale comme point de départ : appliquer la transformée de Fourier aux contours de cellules pour mesurer la forme sous forme d’un spectre de fréquences. Cependant, la transformée LCPC a été développée indépendamment pour être appliquée via des systèmes de grille distincts destinés à être utilisés en conjonction avec la connaissance du contexte spatial en dehors de la forme mesurée. De plus, l’inventeur de la transformée LCPC explique dans ce manuscrit que le spectre de fréquences résultant contient d’immenses quantités d’informations spatiales cachées. Le Fichier Supplémentaire 1 contient une discussion approfondie sur les contextes spatiaux en biologie souvent négligés lors de l’utilisation des méthodes citées et sur la manière dont la transformée LCPC peut être appliquée pour capturer ce contexte. Pour les lecteurs dont les données de forme ne montrent aucune différence entre les groupes témoins et expérimentaux, que leurs yeux puissent voir ou non une différence dans les formes, ou dont les données de forme montrent très peu de différence, même s’ils soupçonnent qu’il devrait y avoir une différence plus importante, ils devraient essayer la transformée LCPC.

La transformée LCPC offre un niveau de précision sans précédent dans la mesure de l’information spatiale car elle représente des formes en plusieurs dimensions. Contrairement aux méthodes traditionnelles, comme la surface et le volume, qui ne donnent qu’une seule valeur scalaire par forme (c’est-à-dire 25^{cm 2}), les résultats de la transformée LCPC peuvent donner plusieurs indices, chacun corrélé à un aspect morphologique différent d’une forme (c’est-à-dire rondeur vs. netteté des coins, lissage vs. dentelage des arêtes). La transformée LCPC décrit une forme 2D en superposant une grille de lignes droites qui croisent son contour. Chaque système de grille possède une origine (Figure 1) ou une ligne de base (Figure 2) à partir de laquelle mesurer la distance linéaire. Voir les figures 1B et 2B pour des organigrammes simplifiés décrivant l’algorithme. Chaque point d’intersection entre les lignes de grille et la courbe de niveau de la forme est détecté. La distance de chaque intersection est ensuite calculée par rapport à une ligne de base ou à l’origine. De cette manière, la transformation LCPC convertit des formes 2D en une série de paires de coordonnées x-y consécutives. La coordonnée x représente la position de la ligne de grille de zéro à infini, tandis que la coordonnée y représente la distance de l’intersection à la ligne de base ou à l’origine. Dans cette forme, qui est une onde sinusoïde discrète, la transformée rapide de Fourier (FFT) est ensuite appliquée pour convertir les données du « domaine de position » vers le domaine fréquentiel. Si la coordonnée x représentait le temps, alors le « domaine de position » serait équivalent au « domaine temporel » dans les applications standard de la FFT.

Alors que le système de grille radiale mesure la distance de chaque intersection depuis l’origine de la grille radiale (Figure 1A), le système de grille parallèle mesure toujours la distance des intersections par rapport à une droite imaginaire située à gauche de la forme (Figure 2A). Le script open source détermine la position de cette ligne imaginaire en trouvant le pixel le plus à gauche du contour, puis en déplaçant 10 pixels à gauche de cette position. Ici, la coordonnée x de cette position devient la ligne de référence à partir de laquelle toutes les intersections sont calculées. Cette règle des 10 pixels est arbitraire, mais c’est pourquoi tous les contours analysés par le script open source pour le système de grille parallèle doivent comporter au moins 15 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés.

Pour les formes 2D avec plis ou plusieurs couches, les lignes de grille peuvent croiser le contour plus d’une fois. Dans ce cas, les distances de toutes les intersections le long d’une ligne de grille sont additionnées en une seule valeur. Ainsi, chaque ligne de grille n’a qu’une seule coordonnée x et une coordonnée y. Cette somme est représentée par le terme « compressé » dans le nom de transformation LCPC. Le rendu d’une forme 2D non linéaire en une onde sinusoïde discrète est représenté par le terme « linéarisé » dans le nom de l’algorithme. Enfin, le terme « coordonnées polaires » figure dans le nom de l’algorithme car le premier système de grille conceptualisé était une grille radiale à 180 degrés de coordonnées^{polaires 7}. Même après avoir réalisé que les coordonnées polaire et cartésienne sont interchangeables, le nom de l’algorithme est resté tel quel. La section remerciements décrit les raisons personnelles qui ont motivé l’invention et l’augmentation de la transformation LCPC.

Le protocole 1 était la séquence pour obtenir les données illustrée à la figure 3B, tandis que le protocole 2 était la séquence pour obtenir les données illustrées à la figure 3C–D. Les étapes de ces protocoles sont implémentées dans des scripts Python individuels disponibles dans le dépôt GitHub « Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform ^»16. Le protocole 1 est un exemple des étapes de prétraitement pour dériver la « forme pure » en préparation de la transformation LCPC. Le protocole 2 est un exemple d’étapes de prétraitement pour mesurer des formes « à l’échelle », c’est-à-dire à leurs échelles d’origine les unes par rapport aux autres.

La segmentation peut être réalisée manuellement dans des logiciels de traitement d’image, tels que Preview Mac ou Microsoft Paint, ou en utilisant des méthodes basées sur des seuils. Si cela se fait manuellement, l’une des quatre couleurs suivantes doit être choisie : bleu, vert, rose/magenta ou rouge. Le dépôt GitHub appelé « Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform ^»16 contient un dossier appelé « color extraction scripts ». Ce dossier contient quatre fichiers Jupyter Notebook avec du code Python qui extraient les quatre couleurs mentionnées précédemment et les convertissent en masques bleus sur fond blanc. Ce processus peut également être réalisé en faisant un seuil de la couleur du contour dans un logiciel de traitement d’image tel que Fiji/ImageJ. Pour les images contenant des contours avec des bordures en contact ou des bords qui se chevauchent (par exemple, un diagramme de Venn), elles devront être séparées à l’aide d’un logiciel de traitement d’image, afin qu’elles deviennent des objets indépendants dans l’image masque composite contenant plusieurs contours organoïdes. Cela ne s’applique pas aux images qui ne contiennent qu’un seul organoïde ou plusieurs organoïdes qui ne se touchent pas.

Protocole

Les cellules humaines primaires utilisées dans cette étude ont été prélevées et cultivées selon des approbations éthiques et des procédures de consentement éclairé précédemment^{rapportées 17}. Les images présentées ici ont été générées à partir de ces cultures cellulaires approuvées et sont publiées pour la première fois. Des échantillons de tissus ont été prélevés à l’hôpital Brigham and Women’s et à l’Université de Californie à San Francisco dans le cadre de protocoles approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) auprès de patients ayant donné leur consentement éclairé pour l’utilisation en recherche de leurs tissus, comme décrit^{précédemment 17}. Aucune collecte supplémentaire de spécimens humains n’a été réalisée pour cette étude.

1. Extraction de la forme pure des contours organoïdes 2D pour la transformée LCPC

1. Segmentez le bord extérieur de chaque organoïde à l’aide de n’importe quel logiciel de traitement d’image, tel que Paint de Microsoft, Preview de MacOS ou Fiji/ImageJ.
2. Extraire les contours des organoïdes sous forme de masques ouverts qui sont des lignes bleues sur fond blanc.
3. Isoler chaque contour bleu sur sa propre toile blanche.
   REMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si une image contient plus d’un contour.
4. Recadrez chaque contour pour qu’il ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu.
5. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges.
6. Faites pivoter les objets de façon à ce que la plus longue longueur interne soit horizontale.
   REMARQUE : Cette étape transforme la ligne interne la plus longue à l’intérieur de chaque objet en largeur de l’objet. Deux scripts sont disponibles à cet effet. Pour les formes fermées, utilisez le carnet Jupyter nommé « Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb ». Pour les formes ouvertes ou les formes avec plusieurs composants, utilisez le Jupyter Notebook nommé « Rotate Green Line_v3.ipynb ». L’outil Rotate Green Line propose un tutoriel vidéo qui est lié dans le fichier ReadMe contenu dans le même dossier que le fichier .ipynb.
7. Recadrez chaque image pour qu’elle ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu.
   REMARQUE : C’est la même chose que l’étape 1.4. Le but de la découpe cette fois, cependant, est que l’étape de redimensionnement qui suit redimensionne toute la toile, pas seulement l’objet bleu qu’elle contient. Ainsi, en rendant l’objet bleu presque de la même largeur et hauteur que la toile elle-même, en redimensionnant la toile à 400 pixels de large, l’objet est aussi proche de 400 pixels de large. Il existe un Jupyter Notebook nommé « Trim margin to 1-pixel border.ipynb ».
8. Redimensionnez la largeur de la toile de chaque image à 400 pixels tout en limitant le format d’aspect.
   REMARQUE : Cette étape fait en sorte que chaque objet ait la même largeur. Limiter le rapport d’aspect empêche de déformer l’objet lors du redimensionnement. Il existe un Jupyter Notebook nommé « Redimensionner la largeur à 400 pixels mais limiter le format d’aspect.ipynb ».
9. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges.
10. Faites pivoter chaque image soit de 90 degrés dans le sens horaire, soit dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour obtenir la plus longue longueur interne, en étant cohérent avec le choix pour toutes les images.
    REMARQUE : Dans la séquence ci-dessus, la forme pure est obtenue en implémentant séquentiellement les étapes 1.6, 1.7, 1.8 et 1.9. Ajouter de l’espace de marge à l’étape 1.9 est nécessaire pour éviter les erreurs dans les scripts de transformation LCPC qui seront effectués ensuite, mais cela n’implique pas l’extraction de la forme pure. Les utilisateurs souhaitant mesurer des formes « à l’échelle » n’ont pas besoin d’effectuer les étapes 1.6, 1.7 et 1.8 dans la séquence ci-dessus, bien qu’ils doivent tout de même prétraiter leurs images de masque pour obtenir une orientation optimale avant d’appliquer la transformation LCPC.
11. Effectuez la transformation LCPC sur chaque contour. Utilisez des scripts Python fournis pour la méthode¹⁸ de la grille radiale ou la méthode¹⁹ de la grille parallèle.

2. Extraction de la forme à l’échelle des contours organoïdes 2D pour la transformée LCPC

REMARQUE : La méthode étape par étape pour extraire la forme à l’échelle des objets est similaire à celle pour extraire la forme pure dans le Protocole 1 ci-dessus. Les étapes sont nommées de la même manière dans les deux protocoles pour faciliter la mise en relation des étapes de la correspondance. Veuillez consulter les notes du Protocole 1 pour chaque étape. La principale différence entre la forme pure et la forme à l’échelle est que la forme à l’échelle ne nécessite pas les étapes 1.6, 1.7 et 1.8, qui sont les étapes de redimensionnement.

1. Segmentez le bord extérieur de chaque organoïde. Utilisez une approche computationnelle ou faites-le manuellement via un logiciel d’édition d’image basique, comme Paint de Microsoft, Preview de MacOS ou Fiji/ImageJ.
2. Extraire les contours des organoïdes sous forme de masques ouverts qui sont des lignes bleues sur une toile blanche. Utilisez Fiji/ImageJ pour extraire des masques ou le script Python^{fourni 16}.
3. Isoler chaque contour bleu sur sa propre toile blanche. Utilisez Fiji/ImageJ pour extraire des masques ou le script Python^{fourni 16}.
4. Recadrez chaque contour pour qu’il ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
5. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
6. Faites pivoter chaque courbe de niveau de façon à ce que sa ligne interne la plus longue soit verticale. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
7. Effectuez la transformation LCPC sur chaque contour. Utilisez des scripts Python fournis pour la méthode¹⁸ de la grille radiale ou la méthode¹⁹ de la grille parallèle.

Résultats

La transformée LCPC en grille radiale appliquée aux organoïdes atteints du cancer du sein

Les organoïdes et tumeurs 3D peuvent adopter une variété de formes, dont certaines sont manifestement différentes à l’œil humain, même si les métriques traditionnelles donnent des différences statistiquement insignifiantes. En revanche, les organoïdes peuvent aussi présenter des formes qui paraissent hétérogènes, et donc insignifiantes, à l’œil humain, ma...

Discussion

Comme pour tout outil informatique, la qualité de la sortie dépend du respect des règles attendues autour desquelles l’outil a été conçu. Les règles suivantes doivent être suivies et utilisées comme contrôles qualité lors de l’utilisation des scripts Python fournis. Tout d’abord, assurez-vous que les masques ouverts soient des lignes bleues sur fond blanc. Le bleu était une décision arbitraire et n’a aucune signification, mais les scripts qui effectuent la transformation LCPC ont été écr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook