Protocole de suivi et de quantification comportementale automatisée chez Drosophila melanogaster

Résumé

Ce protocole utilise l’estimation de la pose par Python pour suivre les points clés du corps chez les Drosophila appariées, facilitant la quantification automatisée des comportements sociaux subtils, notamment dans les interactions sociales, ainsi que les cartes thermiques et les trajectoires locomotrices.

Résumé

Pour développer un outil analytique open source qui surmonte les limites des méthodes traditionnelles de suivi basées sur les centroïdes, nous présentons un protocole pour analyser avec précision les interactions sociales dans des paires de Drosophila en pleine nature. Plus précisément, ce protocole s’inspire du cadre du réseau à haute résolution (HRNet) pour suivre simultanément cinq points clés anatomiques — tête, thorax, abdomen, ainsi que les extrémités gauche et droite — dans le but de générer des données de coordonnées haute résolution pour une analyse quantitative ultérieure des comportements sociaux. Ce protocole fournit un flux de travail complet basé sur Python et une interface graphique (GUI) que nous avons conçue, incluant la construction de jeux de données, l’entraînement de modèles et l’extraction automatisée de coordonnées, ainsi que des modules intégrés pour générer des cartes thermiques d’occupation spatiale, des trajectoires locomotrices et des rapports d’interactions sociales chez les mouches. Pour valider ce cadre, il a été testé en utilisant deux souches largement utilisées, w1118 et Canton-S (CS). Nos résultats ont démontré la stabilité de la détection des points clés et révélé des différences spécifiques au génotype dans l’utilisation spatiale et la structure de la locomotive. Cette méthodologie fournit une base évolutive pour l’éthologie quantitative et l’analyse automatisée des interactions sociales chez Drosophila, tout en réduisant les efforts d’annotation manuelle et en améliorant la reproductibilité.

Introduction

Drosophila melanogaster est un organisme modèle largement utilisé doté d’outils génétiques puissants et de circuits neuronaux bien cartographiés permettant une dissection mécanistique du comportement¹. Il possède une large gamme de comportements sociaux, incluant la cour et l’agressivité, ainsi qu’une forte capacité d’apprentissage 2,3,4,5,6,7,8. Chacune est composée d’éléments moteurs distincts contrôlés par un système nerveux compact mais extrêmement bien organisé. Il est important de souligner que la mesure précise de la posture corporelle est essentielle pour comprendre les fondements neurologiques de la sélection d’action, car beaucoup de ces comportements contiennent des motifs posturaux précis qui encodent des informations contextuelles et de l’état^{interne 9,10}.

Malgré la nécessité d’une résolution à une seule mouche pour capturer les différences individuelles, de nombreux tests comportementaux à haut débit chez Drosophila reposent encore sur des indices au niveau^{du groupe 11}. Les tests comportementaux à haut débit incluent les tests T-maze pour la préférence^{sociale 12,13}, les tests d’espacement social quantifiant la distance entre les vols, ou les paradigmes d’agrégation/évitement sous stimulation^{sensorielle 14} peuvent capturer efficacement les tendances de population. Cependant, elles impliquent intrinsèquement une moyenne entre individus, ce qui masque l’hétérogénéité des séquences d’actions et la structure temporelle des échanges sociaux. Au fil des années, les tentatives d’identification par mouche se sont appuyées sur des méthodes fonctionnellement contraintes, telles que la détection d’événements basée sur des règles utilisant des seuils cinématiques, la soustraction en arrière-plan avec suivi de centroïde, et l’annotation vidéo^{manuelle 15, 16, 17, 18}. En conséquence, des comportements discrets tels que la fonce, le tapotement ou les menaces d’ailes sont souvent ignorés ou mal étiquetés, nécessitant des corrections manuelles importantes. De telles contraintes ont restreint les études mécanistiques qui nécessitent un alignement temporel précis entre l’activité neuronale et les actions individuelles.

Une solution révolutionnaire est désormais disponible grâce aux développements récents en vision par ordinateur et en estimation de pose basée sur l’apprentissage automatique. Des cadres open source comme DeepLabCut¹⁹ et SLEAP²⁰ permettent la détection des parties du corps sans marqueurs, la classification évolutive des actions discrètes et la préservation de l’identité individuelle même lors d’interactions rapprochées. Ces caractéristiques surmontent les inconvénients des approches précédentes basées sur les groupes et les règles, et permettent une quantification répétable de comportements sociaux complexes.

Les interactions individuelles chez Drosophila se caractérisent par des caractéristiques motrices uniques qui indiquent la progression des interactions sociales. L’agressivité, par exemple, inclut des comportements typiques comme la prise en charge, les menaces d’ailes et le grappling, qui représentent tous des stades de conflit^{croissants 21,22}. La parade nuptiale est également définie par l’orientation, l’extension unilatérale des ailes avec la production de chant, le tapotement et la tentative de copulation, qui se rejoignent pour former la séquence temporelle des interactions^{d’accouplement 23}. La capture de ces motifs dépend d’une reconnaissance précise de la posture corporelle et des mouvements^{articulaires 24,25}. En pratique, l’échantillonnage nécessite une haute résolution spatiale et temporelle sur de longues périodes d’enregistrement afin de garantir que des motifs moteurs subtils puissent être précisément détectés et alignés avec l’activité^{neuronale 25,26}.

Ici, nous présentons un cadre open source basé sur la vision pour l’identification automatisée de cinq points clés anatomiques — tête, thorax, abdomen, extrémités des ailes gauche et^{droite 27}. Le système comprend un flux de travail complet pour la construction de jeux de données, l’entraînement de modèles et l’extraction de coordonnées, et produit des données de séries temporelles à haute résolution adaptées à une classification comportementale personnalisable. En automatisant les processus d’annotation manuelle et en standardisant les flux de travail analytiques, notre méthode permet une analyse quantitative à petite échelle des comportements d’interaction sociale, augmentant l’efficacité et la reproductibilité tout en réduisant significativement le temps et la main-d’obra nécessaires à l’analyse.

Pour valider la fiabilité du système, nous l’avons appliqué à deux souches de laboratoire couramment utilisées, w1118 et Canton-S (CS), et observé une détection stable de points clés à travers les cadres, ainsi que des différences spécifiques au génotype dans l’occupation spatiale, les caractéristiques de trajectoire et les indicateurs d’interaction sociale basés sur la distance de la tête et l’angle d’orientation. Les chercheurs peuvent évaluer la pertinence de ce protocole en se basant sur la résolution spatiotemporelle requise (≥30 fps, ≤0,5 mm/pixel) et les conditions d’enregistrement vidéo (éclairage et contraste). La taille des pixels peut être déterminée directement à partir des réglages de la caméra. Une mouche à fruits dont la longueur corporelle est mesurée peut être placée dans le champ de vision d’imagerie pour l’étalonnage. Ce protocole est particulièrement adapté aux scénarios suivants : la nécessité de suivre simultanément deux Drosophiles librement interagissant et de distinguer leurs identités individuelles ; se concentrant sur des postures fines (par exemple, angle de tête et distance) plutôt que seulement sur les positions du centroïde ; durée d’enregistrement dépassant 10 minutes lorsque l’annotation manuelle n’est pas possible ; nécessitant un alignement temporel au niveau de la milliseconde entre les événements comportementaux et l’activité neuronale (par exemple, imagerie du calcium ou électrophysiologie) dans des analyses ultérieures.

Protocole

1. Préparation à la mouche

1. Recueillez et séchez les mouches âgées de 3 à 4 jours sous anesthésie au CO₂ avant les expériences.
   REMARQUE : La durée de l’anesthésie et le débit de CO₂ peuvent varier en fonction des spécifications et de la pression du cylindre de dioxyde de carbone utilisé dans chaque laboratoire. Les mouches doivent être surveillées en continu pendant l’anesthésie, et l’exposition au CO₂ doit être maintenue uniquement jusqu’à ce qu’elles soient complètement anesthésiées et présentent un arrêt complet de leur mouvement.
2. Placez chaque mouche individuellement dans un tube Falcon de 50 mL contenant un milieu standard de semoule de maïs–agar–glucose–levure.
3. Maintenez les mouches à 25 °C sous un cycle clair/sombre de 12 heures jusqu’à utilisation.

2. Construction de l’arène

1. Préparez deux plaques acryliques transparentes de 3 mm et une plaque en polyéthylène de 3 mm.
2. Taillez quatre chambres circulaires (de 35 mm de diamètre chacune) au centre de la plaque de polyéthylène.
3. Utilisez des clips pour coller une plaque acrylique à la plaque en polyéthylène afin de former la base de la chambre ; Gardez la deuxième plaque en acrylique comme couvercle amovible.

Figure 1 : Schéma de l’arène comportementale et de l’installation d’imagerie. (A) La construction d’une chambre d’observation personnalisée est représentée dans le schéma. La chambre se compose de trois couches principales : une base acrylique transparente de 3 mm ; une plaque de polyéthylène de 3 mm avec quatre découpes circulaires de 35 mm de diamètre servant de puits de chambre individuels ; et une seconde plaque en acrylique qui sert de couvercle amovible. (B) Un collier adaptateur à 90° est utilisé pour installer la caméra verticalement sur un poteau optique de 40 cm. Pour l’imagerie descendante, la caméra est positionnée directement au-dessus de l’arène d’observation multicouche, avec son axe optique perpendiculaire à la surface de la chambre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Installation de l’imagerie

1. Assemblez deux poteaux optiques de 20 cm et un poteau de 40 cm avec des colliers adaptateurs à 90°.
2. Montez l’appareil (1280 × 1024 pixels) verticalement sur le poteau de 40 cm, aligné perpendiculairement à la surface de l’arène, et réglez le taux d’images à 150 fps.
3. Placez l’arène sur un panneau LED diurne de 25 cm × 25 cm à 25 cm recouvert d’une feuille de diffusion.
4. Réglez l’éclairage à environ 1500 lux à la surface de l’arène.
   REMARQUE : Assurez-vous que les bords des ailes restent visibles dans l’aperçu binaire. Évitez >2000 lux pour éviter les artefacts induits par la chaleur, car les mouches peuvent modifier leur locomotion ou leur distribution naturelle à cause de la contrainte thermique causée par la source lumineuse.

4. Procédure d’enregistrement

1. Placez des coussinets en mousse de 3 cm sous chaque coin de l’arène pour la stabiliser.
2. Transférer des paires de mouches sous anesthésie CO₂ dans des chambres ; Scellez avec la plaque en acrylique supérieure.
3. Laissez les mouches s’acclimater pendant 40 minutes avant d’enregistrer.
4. Commencez l’acquisition vidéo en^{MIAS.exe 27} : appuyez sur q pour commencer et c pour arrêter.
   REMARQUE : Cela aboutit à des enregistrements vidéo continus de paires de mouches en interaction libre dans des conditions standardisées.

5. Définir le panel d’activités sociales

1. Exécutez le script de prétraitement : python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   REMARQUE : Tous les scripts de codage sont fournis dans le Fichier Supplémentaire 1.
2. Annoter la zone de la chambre et attribuer des métadonnées sous forme de Genotype_age (jours) × 1 (nombre de chambres). (par exemple, CS_3 × 1)
3. Ajustez le curseur de seuil de détection jusqu’à ce que les ailes soient presque invisibles dans l’image binaire afin d’assurer une soustraction en arrière-plan optimale et une visibilité des ailes.

6. Préparation de jeux de données

1. Créez un nouveau dossier de jeu de données en exécutant :
   Outils python/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (intervalle d’échantillonnage de trames)
   REMARQUE : Le paramètre d’intervalle d’échantillonnage de trame (« 10 ») a été adapté d’un^{protocole 27} publié précédemment. Des valeurs plus basses augmentent la densité d’échantillonnage et la charge de calcul, tandis que des valeurs plus élevées réduisent la demande de calcul et peuvent être ajustées en fonction des performances matérielles disponibles et des exigences expérimentales.
2. Configurez le chemin vidéo et le chemin du jeu de données dans les « outils/SoAL_DatasetUtils.py »
3. Interface d’étiquetage manuel de lancement :
   >Outils python/SoAL_LabelUI.py NOM DU JEU DE DONNÉES
   1. Navigation par trame : Appuyez sur la touche Espace ou la touche Z pour naviguer respectivement vers la prochaine ou la précédente. Sinon, utilisez le curseur de la timeline pour la navigation.
   2. Étiquetage des points clés : Cliquez sur la position correcte d’une mouche dans chaque image (dans une séquence spécifique : tête, thorax, abdomen, aile gauche et aile droite) pour marquer les 5 points clés.
   3. Sélection des points clés : Appuyez sur les touches numériques pour sélectionner un point clé (indiqué par un cercle blanc). Le clic suivant réattribuera un nouveau numéro au point clé sélectionné.
   4. Sauvegarde : Fermez la fenêtre ou appuyez sur la touche D pour enregistrer les résultats de l’annotation.
      REMARQUE : Une archive complète de l’ensemble d’entraînement comprend deux composantes : un répertoire d’images et un fichier annotation.json.

7. Entraînement du modèle

1. Divisez le jeu de données en ensembles d’entraînement et de validation :
   Outils python/SoAL_DatasetGen.py DIVISION DES NOMS DE JEUX DE DONNÉES
   Deux nouveaux dossiers seront créés dans « dataset/. »
2. Configurez les paramètres d’entraînement dans hrnet/fly_w32.yàmul :
   Facteur de rotation : 15°
   Facteur d’échelle : 0,35
   Facteur de luminosité : 0,25
   Taille du lot : 24
   Époques : 200
3. Suivez le programme de formation :
   Python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Terminer les séries d’entraînement lorsque la précision moyenne (AP) plafonne ; conserver le meilleur modèle (AP > 90 %).
4. Validez le modèle en utilisant :
   Python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Résultat : Modèle robuste basé sur HRNet pour la détection de points clés multi-fly.

8. Exécuter le programme de détection

1. Copiez de nouveaux fichiers vidéo dans le répertoire vidéo.
2. Annoter les métadonnées comme montré à l’étape 5.
3. Exécuter le programme de détection : python SoAL_KptDetect.py tout
4. Inspectez les résultats de la détection :
   Outils Python/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.CVS/XSLX)
   Résultat : Coordonnées bidimensionnelles de cinq repères anatomiques par mouche à travers les cadres.

9. Quantification comportementale

1. Lancez une application GUI autonome pour l’analyse (Fichier Supplémentaire 2) et importez les fichiers de coordonnées dans l’interface.
2. Générez des cartes thermiques d’occupation spatiale (densité de probabilité des positions dans l’arène).
3. Reconstruis les trajectoires locomotrices à partir de séries temporelles de coordonnées.
4. Créez des données d’interaction sociale, incluant la distance de la tête, l’orientation et l’état social dérivé.
   Résultat : Visualisation standardisée de l’utilisation spatiale spécifique au génotype et de la dynamique des mouvements.

Résultats

La figure 1 illustre la géométrie de l’arène, la configuration d’éclairage et le placement de la caméra utilisés pour enregistrer les interactions sociales naturelles chez Drosophila. Cette installation garantit un éclairage uniforme et des conditions d’imagerie stables, adaptées à l’estimation de la pose et à l’extraction de coordonnées.

L’estimation automatisée de la pose a été appliquée à toutes les vidéos enregistrées...

Discussion

Notre étude montre que l’estimation de la posture basée sur l’apprentissage automatique offre une méthode évolutive et fiable pour mesurer les interactions sociales fines chez Drosophila. Il surmonte les limites des approches basées sur les centres^{de centre 15, 16, 17, 18} en suivant cinq points clés anatomiques en paires librement interagissant, permet...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	custom-made
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	custom-made
Python	/	version 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	custom-made
Yeast	Angel	100004237033