Criblage à haut débit des mutants de Bacillus coagulans hyperproducteur d’acide L-lactique utilisant une plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes

Résumé

Ce protocole présente un flux de travail standard de criblage à haut débit pour les micro-organismes industriels. Il consiste à construire une bibliothèque de mutants via la mutagenèse ARTP, à effectuer un dépistage de gouttelettes positif avec microfluidique automatisée, puis à vérifier les résultats. La fiabilité du flux de travail a été validée en criblant des souches à haut rendement de B. coagulans .

Résumé

La bioproduction industrielle repose sur des micro-organismes pour synthétiser efficacement les produits cibles dans des conditions d’ingénierie. Cependant, les souches de type sauvage ne peuvent souvent pas le faire en raison de leurs réseaux métaboliques natifs. Par conséquent, le dépistage rapide et précis des souches à haute performance issues de grandes bibliothèques de mutants constitue une étape cruciale dans la sélection microbienne industrielle. Ces dernières années, la technologie microfluidique à gouttelettes a attiré une attention significative en raison de son débit élevé, de sa faible consommation et de ses capacités de compartimentation monocellulaire, conduisant au développement de nombreux systèmes de tri monocellule. Un protocole de dépistage à haut débit pour les souches microbiennes industrielles utilisant une plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes est présenté dans cette étude. Le flux de travail intégré comprend quatre étapes clés : la construction d’une bibliothèque de mutants via la mutagenèse par plasma atmosphérique et à température ambiante (ARTP) ; une encapsulation unicellulaire à haute efficacité et une micro-culture contrôlée au sein de gouttelettes à l’échelle du picolitre ; injection précise de pico-injection d’un biocapteur fluorescent, suivie d’un tri de gouttelettes activé par fluorescence (FADS) pour isoler les gouttelettes contenant des variants à haute production ; et la validation des souches candidates triées par fermentation en microplaques et en flasques de secouage. Un flux de travail de dépistage complet et intégré est conçu comme un modèle standardisé, et sa validation est démontrée par l’isolement de mutants producteurs d’acide L-lactique à haut rendement de B. coagulans , à titre d’exemple précis. Cette plateforme automatisée de criblage à haut débit offre une solution technique puissante avec un potentiel significatif pour accélérer l’amélioration industrielle de souches haute performance.

Introduction

La biotechnologie industrielle utilise des micro-organismes et des enzymes comme biocatalyseurs pour produire des produits précieux à grande échelle. Cette approche est considérée comme plus respectueuse de l’environnement et efficace que la fabrication chimique traditionnelle. Cependant, les réseaux métaboliques naturels des micro-organismes ont évolué pour prioriser leur propre survie et reproduction plutôt que la synthèse efficace des produits désirée par l’homme. En conséquence, la sélection microbienne à haut débit est souvent nécessaire pour répondre aux exigences des environnements de production industrielle dans des conditions^{strictes 1,2,3}. Ce processus consiste à construire rapidement des bibliothèques microbiennes mutantes à grande échelle par mutagenèse physique ou chimique, suivie de la culture et de la détection phénotypique de mutants aux génotypes distincts. Seule une petite fraction des souches supérieures est alors sélectionnée. Cependant, les technologies traditionnelles de criblage à base de plaques et de microplaques sont entravées par des procédures lourdes, un faible débit et un coût élevé. Ce goulot d’étranglement, associé à la consommation importante de consommables et de réactifs, entraîne une faible efficacité globale de la sélection^{microbienne 4,5}.

La microfluidique des gouttelettes est récemment apparue comme une solution transformatrice à ce défi. Contrairement au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui est peu adapté au criblage des produits sécrétés en raison de la diffusion rapide des molécules loin de la cellule, le tri des gouttelettes activé par fluorescence (FADS) encapsule des cellules individuelles dans des micro-réacteurs compartimentés à l’échelle du^{picolitre 6,7,8}. Cet isolement physique empêche la compétition des souches, permet l’accumulation localisée des métabolites sécrétés et permet leur détection quantitative via des biocapteurs fluorescents. Par conséquent, le FADS s’est avéré être une plateforme idéale pour le criblage à haut débit de divers produits extracellulaires, y compris les acides aminés, les acides organiques et les enzymes. Une équipe a développé le biocapteur fluorescent génétiquement codé GECFINDER, et combinée à FADS, elle a réussi à cribler des souches à haute production de phénylalanine et a amélioré l’efficacité du criblage de plus de 1000 fois⁹. Un autre groupe a mis en place une plateforme de tri de gouttelettes activée par fluorescence couplée à un biocapteur codé génétiquement pour un criblage à haut débit des souches productrices d’acide 3-déshydroshikimique chez E. coli, et le système FADS optimisé a considérablement amélioré l’efficacité du criblage et permis l’isolement de souches mutantes avec une production significativement^{améliorée 10}. Certains chercheurs ont appliqué la technologie FADS à l’ingénierie de la polymérase de l’ADN Bst, et les mutants acquis avec une grande thermostabilité et une activité de déplacement des brins ont été appliqués à la détection LAMP, ce qui a réduit le temps de réaction de 40 min à 10 min¹¹.

Cependant, la traduction de ces avancées technologiques en flux de travail industriels réguliers de développement de la contrainte reste un défi. De nombreux systèmes microfluidiques à gouttelettes commerciaux, malgré leur matériel sophistiqué, manquent d’une procédure opérationnelle standard, complète, intuitive et reproductible, adaptée au dépistage phénotypique microbien. Pour combler cette lacune, une plateforme microfluidique automatisée intégrant le contrôle fluidique modulaire, un logiciel convivial et une conception standardisée de puces a été adoptée, posant ainsi une base technique idéale pour l’établissement d’un flux de travail de dépistage entièrement intégré. Cette étude utilise le criblage à haut débit de B. coagulans producteurs d’acide L-lactique à haut rendement comme cas de validation. Basé sur une plateforme microfluidique à gouttelettes, le flux de travail suivant a été établi, comprenant quatre étapes séquentielles clés : (1) construction d’une bibliothèque mutant diversifiée via mutagenèse atmosphérique et plasma à température ambiante (ARTP) ; (2) encapsulation unicellulaire à haute efficacité et micro-culture contrôlée dans des gouttelettes dans des conditions optimisées pour la croissance de B. coagulans et la production d’acide L-lactique ; (3) pico-injection précise d’un biocapteur fluorescent spécifique au L-lactate, suivie d’un tri rapide des gouttelettes encapsulant des producteurs supérieurs ; et (4) une validation rigoureuse des candidats triés par fermentation en flasque de shake afin de confirmer une production accrue et une stabilité génétique. Ce protocole est destiné aux chercheurs et ingénieurs impliqués dans la sélection microbienne industrielle qui nécessitent un dépistage à haut débit de produits extracellulaires. Il convient particulièrement aux bactéries cultivables qui sécrètent de petits métabolites ou enzymes. La plateforme de dépistage doit être équipée de capteurs compatibles avec le microenvironnement des gouttelettes afin de permettre une détection spécifique des métabolites cibles. Pour les variétés avec des exigences de culture particulières (par exemple, des anaérobies stricts), les paramètres de culture peuvent être adaptés afin d’optimiser et d’établir une stratégie de culture dédiée. En établissant ce flux de travail de dépistage standardisé et en boucle fermée, cette étude vise à fournir une solution puissante et transférable pour accélérer la sélection industrielle des souches.

Protocole

Aucune approbation éthique n’était requise pour cette étude. Toutes les expériences ont été menées à l’aide de cultures microbiennes pures, et aucun sujet humain ni animal de laboratoire n’a participé à cette recherche. Voir le tableau des matériaux pour les détails sur tous les matériaux utilisés dans le protocole suivant.

1. Préparatifs

ATTENTION : Suivez les pratiques de biosécurité. B. coagulans est un organisme de biosécurité de niveau 1. Porte des gants et une blouse de laboratoire. Effectuez toutes les manipulations ouvertes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Autoclave tous les matériaux entrant en contact avec des cellules vivantes à 121 °C pendant 20 minutes avant leur élimination.

1. Source de déformation et maintenance
   1. Achetez B. coagulans ATCC 7050 dans un centre de collecte de cultures commerciales en tant que culture inclinée de deuxième génération.
   2. Tracez une boucle de la culture inclinée sur l’agar du milieu de graines et faites éclore à 50 °C pendant 24 heures. Choisissez une seule colonie, inoculez-la dans un milieu liquide pour semencer, et faites pousser à 50 °C, 200 tr/min pendant 12 heures.
   3. Mélangez la culture obtenue avec du glycérol stérile à 40 % jusqu’à une concentration finale de 25 % (v/v) et conservez sous forme de bouillons congelés à –80 °C. Pour chaque expérience, décongelez une aliquote fraîche, traînez-la sur un agar de substrat de graines, puis étouffez à 50 °C pendant 24 heures.
   4. Ensuite, sélectionnez une colonie unique, inoculez-la dans un milieu liquide pour semences, et cultivez à 50 °C, 200 tr/min pendant 12 heures avant d’utiliser pour la mutagenèse et le criblage (Figure supplémentaire 1).
2. Capteur à acide lactique
   1. Exprimer et purifier le capteur eLACCO1.1 comme décrit dans les Matériaux^{Supplémentaires 12} (Figure Supplémentaire 2).
   2. Compléter le capteur purifié avec du glycérol à 5 % (v/v) et conserver à –80 °C. Pour chaque expérience, décongelez une aliquote sur de la glace et diluez-la immédiatement avec un PBS stérile de 10 mM (pH 7,4) jusqu’à une concentration finale de 0,1 mg/mL.
3. Préparation des milieux culturels
   1. Milieu de semences (g/L : glucose 20, extrait de levure 5, tryptone 10, acétate de sodium 2, citrate de sodium 2, K_{2HPO 4} 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO 4,7H₂O 0,01). Stérilisez le glucose séparément sous forme de bouillon de 200 g/L à 115 °C pendant 20 minutes.
      1. Autoclave des composants restants à 121 °C pendant 15 minutes. Après refroidissement, ajoutez un stock de glucose stérile à une concentration finale de 20 g/L, puis filtrez-stérilisez les oligo-éléments.
      2. Conservez le milieu complet à 4 °C pendant une semaine pouvant aller. À utiliser pour l’activation nocturne, la préparation de l’inocule.
   2. Milieu de criblage (g/L : glucose 20, extrait de levure 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na_{2HPO 4} 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Stériliser le glucose séparément à 115 °C pendant 20 minutes. Autoclave le mélange d’extrait de sel et levure à 121 °C pendant 15 minutes.
      2. Après le refroidissement, ajoutez le stock de glucose stérile à 20 g/L. Conservez à 4 °C pendant une semaine. Utilisé comme phase aqueuse pour la génération de gouttelettes et comme milieu de culture à l’intérieur des gouttelettes pendant les 10 heures d’incubation.
   3. Milieu de fermentation (g/L : glucose 90, tryptone 13,33, extrait de levure 13,33, acétate de sodium 0,67, NaCl 0,0133, MgSO_4,7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO 4,7H ₂O 0,0133).
      1. Stérilisez le glucose sous forme de bouillon de 500 g/L à 115 °C pendant 20 minutes. Autoclave des autres composants à 121 °C pendant 15 minutes.
      2. Après le refroidissement, ajoutez le stock de glucose stérile à 90 g/L. Ajoutez de la poudre stérile de_{CaCO 3} (4 % en p/v) juste avant l’inoculation pour tamper le pH. Préparez du neuf chaque jour. À utiliser pour le criblage primaire sur microplaques et la validation par flasques de secouage.
         REMARQUE : Préparez tous les milieux contenant de l’eau distillée à un volume final de 1 L. Ajustez le pH à 6,5 avec 1 M HCl.

2. Construction d’une bibliothèque de mutants utilisant ARTP

ATTENTION : Le fonctionnement ARTP implique un plasma haute fréquence et une lampe UV. Les rayons UV peuvent provoquer des lésions oculaires et cutanées. La décharge plasmaque génère de l’ozone et des températures élevées. Gardez toujours la porte de la chambre fermée pendant que le plasma est allumé. Portez une blouse de laboratoire et des lunettes anti-UV. N’utilisez que 99,999 % d’hélium pur ; Assurez-vous d’une ventilation adéquate. Après chaque opération de mutagenèse, essuyez l’établi et les parois intérieures de la chambre de mutagenèse avec un chiffon sans peluches trempé dans 75 % d’éthanol (v/v). L’éthanol à 75 % est très inflammable. Éloignez-vous des flammes ouvertes, des étincelles et des surfaces chaudes.

1. Établir une courbe standard corrélant OD₆₀₀ à la concentration cellulaire viable.
   1. Inoculez une seule colonie de B. coagulans dans un milieu de graines et étouffez à 50 °C, 200 tr/min pendant 12 h jusqu’à ce que la culture atteigne la phase logarithmique moyenne.
   2. Préparez des dilutions en série de la suspension bactérienne aux gradients de 10⁴, 10⁵ et 10⁶.
   3. Pipeter 100 μL de chaque dilution et répartir uniformément sur les plaques d’agar du milieu de graine en triple lière.
   4. Incubez toutes les plaques d’agar plaquées à 50 °C pendant 24 h.
   5. Comptez les unités formant la colonie (UFC) pour chaque dilution.
      REMARQUE : L’étalonnage montre que_{OD 600} = 0,5 correspond à environ 1 × 10⁸ UFC/mL. Utilisez cette relation pour déterminer la densité cellulaire initiale pour l’encapsulation des gouttelettes (Figure supplémentaire 3).
2. Cultivez B. coagulans jusqu’à la phase logarithmique moyenne à tardive, puis diluez la culture de graines fraîches jusqu’à un OD₆₀₀ = 0,05 dans un milieu de semences frais.
3. À l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire, préparez huit petits disques métalliques stériles et un grand disque métallique. Faites brûler les huit petits disques sur un brûleur à alcool pendant 1 minute, placez-les sur le grand disque stérile, puis laissez-les refroidir pendant 10 minutes.
4. À l’aide d’une micropipette, répartez uniformément 10 μL de la suspension bactérienne diluée sur chacun des huit petits disques refroidis.
5. Transférez le grand disque transportant les petits disques inoculés dans une boîte de Petri stérile.
6. Allumez l’instrument ARTP et activez l’écran de contrôle principal. Allumez la lampe UV à l’intérieur de la chambre de mutagenèse. Démarrez le refroidisseur et pré-refroidissez pendant 20 minutes jusqu’à ce que la température se stabilise à 20 °C.
7. Ouvrez rapidement la porte de la chambre de mutagenèse et placez les petits disques à l’intérieur.
8. À l’aide de pinces stériles, transférez séquentiellement chaque petit disque sur l’étape d’échantillonnage ARTP.
   REMARQUE : La puissance RF, le débit d’hélium, la distance buse-échantillon et la pureté de l’hélium étaient fixés respectivement à 120 W, 10 SLM, 2 mm et 99,999 %. Le temps d’irradiation à l’hélium a été réglé à 5, 10, 15, 20, 25 et 30 s respectivement.
9. Soumettez chaque petit disque à la mutagenèse ARTP selon les paramètres établis. Après irradiation, transférez tous les disques dans un tube centrifugeuse de 50 mL contenant 10 mL de milieu de récupération. Incubez à 50 °C avec des secousses à 200 tr/min pendant 4 heures pour permettre la récupération et la prolifération cellulaire.
10. Détermination du taux de létalité.
    1. Diluer en série la culture récupérée à un gradient de ^10-2 à ^10-6.
    2. Étalez 100 μL de chaque dilution sur des plaques d’agar du milieu de graine, puis préparez trois réplications pour chaque dilution.
    3. Incubez toutes les plaques à 50 °C pendant 24 heures.
    4. Comptez les colonies et calculez l’UFC/mL correspondant.
    5. Calculez le taux de létalité à l’aide de la formule suivante :
       (1)
       REMARQUE : Effectuez l’expérience en triple exemplaire pour chaque moment précis. Le temps optimal de mutagenèse pour l’ARTP dans ce cas est de 20 s (Figure supplémentaire 4).

3. Composition de la plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes et des consommables

1. Système d’actionnement (Figure 1)
   REMARQUE : Il se compose de 3 canaux de contrôleurs de pression haute précision avec une plage de pression de 0 à 1000 mbar et un temps de réponse de pression de < 50 ms (Figure 1A).
2. Système d’imagerie
   REMARQUE : L’imagerie microscopique CMOS haute vitesse offre une acquisition de données d’image à haute vitesse de ≥ 2 Go/s, un taux d’images de 0 à 20 000 fps, et une résolution maximale de 1280 x 860. Le système dispose d’une mise au point automatique pour l’observation en temps réel des mouvements de gouttelettes et prend en charge l’enregistrement d’images et de vidéos, qui peuvent être exportées sous plusieurs formats, dont BMP, AVI, MP4 et TIF.
3. Système de détection
   REMARQUE : Il permet la détection du signal fluorescent avec 2 lasers : 488 nm et 633 nm, ainsi que 2 canaux de détection.
4. Système de contrôle hôte
   REMARQUE : Contrôlé par le logiciel automatisé de plateforme microfluidique de gouttelettes, le système intègre plusieurs modules, incluant l’actionnement des fluides, l’imagerie microscopique, l’excitation et la détection, la génération de gouttelettes, la pico-injection et le tri. Il supporte également l’acquisition, l’enregistrement, le stockage, l’affichage et l’exportation des données expérimentales. Les unités de fonctionnement partielles de la plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes sont présentées (Figure 1B).
5. Consommables
   REMARQUE : Les consommables utilisés dans ce protocole comprennent : tube d’injection pour la phase huileuse, échantillon et réactif (Figure 2A) ; tube de collecte pour l’incubation des gouttelettes (Figure 2B) ; puce de génération de gouttelettes (Figure 2C) ; Puce d’injection de pico-gouttelettes (Figure 2D) ; et puce de tri de gouttelettes (Figure 2E).

4. Génération de gouttelettes

ATTENTION : Nettoyez la plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes. Après chaque expérience, essuyez l’étage, le porte-puces et les zones déversées avec 75 % d’éthanol à l’aide de lingettes sans peluches. Retirez l’huile fluorée résiduelle, la suspension à cellules ou la solution capteur.

1. Encapsulation unicellulaire. Pour obtenir λ = 0,1 sur 14 gouttelettes pL, diluez la suspension bactérienne à_{OD 600} ≈ 0,04 (OD₆₀₀=0,5 correspond à 1 × 10⁸ UFC/mL). Selon la distribution de Poisson :
   (2)
   Lorsque λ = 0,1, 90,5 % des gouttelettes sont vides, 9,1 % contiennent une seule cellule et 0,4 % plusieurs cellules.
   REMARQUE : Dans ce cas, l’efficacité mesurée de l’encapsulation monocellulaire était de 11,2 % (Figure supplémentaire 5). Le nombre de cellules par gouttelette peut être déterminé par coloration DAPI. Lorsque λ = 0,1 et que le taux d’encapsulation multi-cellules dépasse 1 %, la OD₆₀₀ doit être réduite afin de diminuer la proportion de gouttelettes contenant plusieurs cellules.
2. Pipeter 300 μL d’huile fluorée dans le flacon d’entrée de la phase huileuse. Pipeter 500 μL de la suspension bactérienne dans le flacon d’entrée de la phase aqueuse.
3. Enlève le ruban qui couvre la surface de la puce de génération de gouttelettes. Reliez le flacon de pétrole, le flacon d’échantillon et le flacon de collecte aux puits correspondants de la puce dans l’ordre.
4. Placez la puce sur la scène et sécurisez-la. Reliez les tubes d’air aux fioles d’entrée un par un selon les étiquettes du chemin du gaz.
5. Ouvrez le logiciel automatisé de plateforme microfluidique à gouttelettes. Ajustez le bouton de mouvement de l’étage selon la direction des flèches sur la puce pour déplacer le champ de vision vers le site de génération des gouttelettes.
6. Cliquez sur « Start » dans l’interface « Génération de gouttelettes » du logiciel automatisé de plateforme microfluidique de gouttelettes (Figure 3A). Dans l’interface d’imagerie, faites glisser les curseurs de « l’axe Z » et de la luminosité de la source de lumière pour ajuster la clarté et la luminosité de l’image.
7. Cliquez sur les boutons « + » et « - » de « Vitesse de gouttelettes » et « Taille des gouttelettes » pour ajuster la vitesse de génération et la taille des gouttelettes.
   REMARQUE : Dans ce cas, la pression en phase huileuse et la pression en phase d’échantillon pour la génération de gouttelettes sont automatiquement réglées respectivement à 300 mbar et 400 mbar, pour atteindre un débit de génération de 1500 Hz. Sous ces réglages, les gouttelettes ont un volume de 14 pL, avec un CV du diamètre des gouttelettes maintenu en dessous de 5 %, assurant une taille constante des gouttelettes et des opérations fiables en aval.
8. Attendez 1 minute jusqu’à ce que l’équipement se stabilise et que l’état de génération des gouttelettes reste stable. Remettez rapidement la fiole de collecte pour commencer la collecte des gouttelettes.
   REMARQUE : Préajoutez une petite quantité d’huile fluorée dans le nouveau tube de collecte pour couvrir le port inférieur du tube en téflon, afin que les gouttelettes ne touchent pas directement la paroi du tube et ne provoquent pas la fusion.
9. Arrêtez la collecte des gouttelettes après 30 minutes de fonctionnement. Cliquez sur « Arrêter » dans la fenêtre contextuelle pour confirmer l’arrêt de la génération de gouttelettes.
10. Retirez doucement le tube de collecte de la puce. Placez le tube et le flacon de collecte à la verticale et attendez que les gouttelettes dans le tube entrent dans le flacon de collecte.
11. Retirez la puce, le flacon d’entrée en phase huileuse et le flacon d’entrée en phase aqueuse de l’étage. Essuyez la surface de la scène avec de l’alcool à 75 %. La phase de génération des gouttelettes est alors complétée.

5. Culture des gouttelettes

1. Ajoutez 1 mL d’huile minérale dans le tube de collecte.
   REMARQUE : La couche d’huile minérale recouvre la suspension de gouttelettes afin de minimiser l’évaporation et de réduire l’exposition à l’oxygène, tout en permettant un échange gazeux suffisant pour l’anaérobe facultatif B. coagulans.
2. Placez le tube de collecte à la verticale dans un tube centrifugeuse de 15 mL contenant de l’eau stérile. Gardez le tube de collecte légèrement bouché et éclovez à 45 °C pendant 10 heures.
   REMARQUE : Après l’incubation, assurez-vous que le diamètre CV des gouttelettes est de <10 % et qu’aucune coalescence des gouttelettes n’est observée. Jetez les lots si ces critères ne sont pas remplis.

6. Pico-injection de gouttelettes

ATTENTION : La haute tension est appliquée aux électrodes de la puce via la connexion de l’instrument lors de l’injection pico-injectable. Le champ électrique peut provoquer un choc électrique sévère. Ne touchez pas les électrodes ni la surface de la puce avec des outils métalliques ou les mains nues tant que la haute tension est active. Désactivez toujours la sortie haute tension avant de manipuler la puce. Portez des gants isolants et utilisez des outils non conducteurs.

1. Préparez le flacon d’entrée en phase huileuse. Dans la hotte à écoulement laminaire, pipettez 300 μL d’huile fluorée dans le flacon d’entrée de la phase huileuse.
2. Préparez le flacon d’entrée d’échantillon. Retirez le bouchon de la fiole d’entrée du tube de collecte contenant les gouttelettes. Remplacez-le par un nouveau bouchon.
3. Taillez la pointe du nouveau flacon d’entrée. Coupez une petite portion à l’avant du nouveau flacon d’entrée afin que la pointe atteigne en dessous du niveau liquide des gouttelettes dans le flacon de l’échantillon.
4. Serre le bouchon. Fixez bien le bouchon pour éviter toute fuite.
5. Préparez le flacon d’entrée du réactif. Pipeter 500 μL du capteur d’acide lactique dans le flacon d’entrée du réactif.
6. Ajoutez le PBS à l’entrée du réactif. Simultanément, ajoutez 500 μL de tampon PBS stérile au même flacon d’entrée de réactif.
   REMARQUE : Un tampon PBS est ajouté dans cette expérience pour équilibrer le pH des gouttelettes. La concentration finale de travail du capteur de lactate était de 0,1 mg/mL, et le volume de charge du capteur de lactate était de 500 μL.
7. Utilisez une lame pour couper le ruban qui recouvre les puits d’électrodes afin d’exposer les électrodes. Réglez le multimètre en mode continuité et testez la connexion du circuit ainsi que l’état du court-circuit de la puce.
   REMARQUE : Si le multimètre indique une connexion normale du circuit des électrodes de la puce, passez à l’étape suivante. Si le circuit est ouvert, remplacez la puce d’injection et testez à nouveau.
8. Après avoir confirmé la connexion normale du circuit avec le multimètre, retirez la bande sur la surface de la puce. Reliez le flacon d’huile, le flacon d’échantillon, le flacon réactif et le flacon de collecte aux puits correspondants de la puce dans l’ordre.
9. Placez la puce sur la scène et sécurisez-la. Reliez les tubes d’air aux fioles d’entrée un par un selon les étiquettes du chemin du gaz.
10. Ouvrez le logiciel automatisé de plateforme microfluidique à gouttelettes. Ajustez le bouton de mouvement de l’étage selon les directions des flèches sur la puce pour déplacer le champ de vision vers la zone de l’électrode de la puce gouttelette.
11. Cliquez sur « Start » dans l’interface « Droplet Pico-injection » du logiciel automatisé de plateforme microfluidique de gouttelettes (Figure 3B). Dans l’interface d’imagerie, faites glisser les curseurs de « l’axe Z » et de la luminosité de la source de lumière pour ajuster la clarté et la luminosité de l’image.
    REMARQUE : À ce stade, l’instrument ajuste automatiquement la pression de la pompe en phase huileuse à 400 mbar, la pression de la pompe en phase d’échantillonnage à 420 mbar, et la pression de la pompe en phase d’injection réactif à 450 mbar.
12. Au stade initial de fonctionnement, un segment d’air dans le cathéter est déchargé dans la puce, ce qui est un phénomène normal qui dure plusieurs minutes.
13. Attendez que des gouttelettes entrent dans le champ de vision. Cliquez sur « Démarrer l’injection de Pico ». À ce moment-là, le champ électrique de l’équipement sera activé. Ajustez la vitesse de génération des goutteles, l’espacement des gouttelettes et le volume d’injection en cliquant sur les boutons « + » et « - » de « Vitesse des gouttelettes », « Espacement des gouttelettes » et « Volume d’injection ».
    REMARQUE : Le champ électrique est réglé sur la vitesse maximale par défaut. Si des gouttelettes se brisent dans la région du champ électrique lors du processus de fusion, passez à une vitesse moyenne ou basse. Dans ce cas, le débit d’injection de gouttelettes était de 200 Hz.
14. Observez dans le logiciel d’affichage d’images haute vitesse. Si les gouttelettes peuvent s’injecter de manière stable dans le capteur d’acide lactique à un ratio 1:1, attendez 5 minutes que l’équipement se stabilise. Remettez rapidement la fiole de collecte pour commencer la collecte des gouttelettes.
15. Après une injection stable pendant 2 heures, cliquez sur « Stop » pour mettre fin à la pico-injection de gouttelettes.
16. Retirez doucement le tube de collecte de la puce. Placez le tube et le flacon de collecte à la verticale et attendez que les gouttelettes dans le tube entrent dans le flacon de collecte.

7. Tri des gouttelettes

ATTENTION : Le démulsifiant est un irritant et peut provoquer une irritation de la peau et des yeux. Elle est également nocive si elle est inhalée ou avalée. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire, lunettes de sécurité). Manipulez le démulsifiant dans un endroit bien ventilé ou une hotte à fumées. Collectez les déchets de démulsifiant dans un contenant séparé, clairement étiqueté. Ne versez pas dans l’évier.

1. Dans la hotte à flux laminaire, pipeter 300 μL d’huile fluorée et l’ajouter à la fiole d’entrée en phase huileuse. Remplacez le bouchon de la fiole d’entrée du tube de collecte contenant les gouttelettes microinjectées par un nouveau bouchon.
   REMARQUE : Avant de réaliser des expériences de tri des gouttelettes, prenez 5 μL de gouttelettes et observez-les au microscope à fluorescence. Mesurer le diamètre d’au moins 200 gouttelettes ; Ne procédez que si le CV < 10 %.
2. Utilisez une lame pour couper le ruban qui recouvre les puits d’électrodes afin d’exposer les électrodes. Réglez le multimètre en mode continuité et testez la connexion du circuit ainsi que l’état du court-circuit de la puce.
3. Après avoir confirmé la connexion normale du circuit avec le multimètre, retirez la bande sur la surface de la puce. Reliez le flacon de pétrole, le flacon d’échantillon et le flacon de tri à la collecte aux puits correspondants de la puce dans l’ordre.
4. Placez la puce sur la scène et sécurisez-la. Reliez les tubes d’air aux fioles d’entrée un par un selon les étiquettes du chemin du gaz.
5. Ouvre le logiciel d’imagerie haute vitesse. Ajustez le bouton de mouvement de l’étage selon les directions des flèches sur la puce pour déplacer le champ de vision vers la zone de l’électrode de la puce gouttelette.
6. Cliquez sur « Start » dans l’interface « Tri des gouttelettes » du logiciel automatisé de la plateforme microfluidique des goutteles. Dans l’interface d’imagerie, faites glisser les curseurs de « l’axe Z » et de la luminosité de la source de lumière pour ajuster la clarté et la luminosité de l’image.
   REMARQUE : Après avoir cliqué sur « Start », l’instrument ajuste automatiquement la pression de la pompe à huile à 300 mbar et celle de la pompe d’échantillon à 190 mbar, ce qui donne un débit de gouttelettes de 100 Hz.
7. Au stade initial de fonctionnement, un segment d’air dans le cathéter est déchargé dans la puce, ce qui dure plusieurs minutes et constitue un phénomène courant.
8. Cliquez pour sélectionner le « Laser » et choisissez le canal de détection 488 nm.
   REMARQUE : Le personnel expérimental peut choisir un laser de 488 nm, un laser de 633 nm, ou une combinaison des deux, selon le plan de détection expérimental. Puissance laser : 20 mW.
9. Cliquez sur « Enregistrement des données ». L’instrument commencera à capter des signaux de fluorescence de gouttelettes (Figure 3C).
   REMARQUE : Collecter des signaux de fluorescence de 50 000 à 100 000 gouttelettes ; L’instrument triera automatiquement les valeurs du signal et générera un histogramme du signal de fluorescence.
10. Sur la base de l’histogramme du signal de fluorescence généré, fixez le seuil de tri au top 0,1 % des signaux de fluorescence totaux, et collectez les gouttelettes dont les valeurs du signal de fluorescence dépassent ce seuil.
    REMARQUE : Dans ce cas, la porte de tri était réglée pour collecter des gouttelettes d’intensité de fluorescence > 2750 (u.a.), ce qui correspondait au 0,1 % supérieur des gouttelettes.
11. Cliquez à nouveau sur « Enregistrement des données ». L’instrument réenregistrera les signaux de fluorescence des gouttelettes restantes et triera les gouttelettes cibles selon le seuil fixé à la Section 7.10.
    REMARQUE : Les signaux gouttelettes restants seront également automatiquement triés et tracés sous forme d’histogramme de fluorescence.
12. Après avoir sélectionné la région de gouttelettes ciblées, activez l'« Interrupteur de tri » et définissez la valeur « Force de déviation ». Le matériel commencera à trier les gouttelettes.
    REMARQUE : L’instrument fournit trois niveaux de champ électrique sélectionnables (Élevé, Moyen, Bas). Pour les gouttelettes supérieures à 30 μm, sélectionnez Haut ; pour les gouttelettes inférieures à 25 μm, sélectionnez Moyen ou Bas. Cela garantit une déviation stable et une efficacité optimale de tri.
13. Après que l’équipement se soit stabilisé pendant 5 minutes, remet le flacon de collecte pour recueillir les gouttelettes positives.
    REMARQUE : Lors du tri, l’instrument mesure en continu l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette en temps réel et la compare au seuil prédéfini. Seules les gouttelettes dont l’intensité de fluorescence dépasse le seuil sont déviées et collectées dans le tube de collecte positive. Une gouttelette est considérée comme positive si l’instrument affiche un signal de fluorescence dépassant le seuil de tri et, simultanément, une déviation de gouttelettes est observée dans l’interface d’imagerie, confirmant que la gouttelette a été dirigée avec succès vers le canal de collecte positive.
14. Arrêtez le tri des gouttelettes après 4 heures de fonctionnement stable. Cliquez sur « Arrêter » dans l’interface « Tri des gouttelettes ».
15. Retirez doucement le tube de collecte de la puce. Placez le tube et le flacon de collecte à la verticale pour s’assurer que les gouttelettes dans le tube entrent dans le flacon de collecte.
16. Après la collecte des gouttelettes terminée, cliquez sur le diagramme de points pour enregistrer le diagramme de diffusion de l’expérience, les valeurs du signal de fluorescence des gouttelettes positives triées, et les valeurs du signal de fluorescence de toutes les gouttelettes.
17. Retirez la puce, le flacon d’entrée de phase huileuse, le flacon d’échantillon et le flacon du réactif de l’étage. Fermez le logiciel.
18. Démulsification des gouttelettes. Ajoutez 500 μL de 1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctanol dans le tube de collecte de gouttelettes. Attendez 5 minutes, puis ajoutez 500 μL de milieu de criblage frais pour la récupération.
    REMARQUE : Ne secoue pas vigoureusement le tube de collecte après avoir ajouté le démulsifiant ; Mélange doucement. Après la démulsification par gouttelettes, une interface claire se forme entre les phases aqueuse et huileuse.
19. Prenez 20 μL de suspension bactérienne démulsisée, diluez-la 10 fois, puis étalez-la sur deux plaques d’agar. Incubez à 50 °C pendant 2 jours.
    REMARQUE : Le facteur de dilution peut être ajusté en fonction du nombre de gouttelettes collectées. Dans ce cas, environ 400 colonies individuelles ont été obtenues à partir des deux plaques.

8. Exportation des données

1. Cliquez sur le graphique du signal de fluorescence dans la zone vide de l’interface de tri logicielle. Sélectionnez pour enregistrer le diagramme de diffusion du signal de fluorescence des goutteles, l’histogramme du signal de fluorescence et le tableau Excel du signal de fluorescence, qui contiennent les valeurs d’intensité de fluorescence enregistrées du nombre total de gouttelettes ainsi que les valeurs d’intensité de fluorescence des gouttelettes positives criblées.

9. Criblage primaire des microplaques

1. Choisissez des colonies individuelles au hasard.
2. Inoculez la plaque profonde de 24 puits pour la culture d’expansion. Sélectionnez chaque colonie sélectionnée et inoculez-la dans un puits d’une plaque de 24 puits profonds contenant 2 mL de milieu de fermentation. Utilisez une boucle d’inoculation.
3. Scellez la plaque profonde à 24 puits avec une membrane non respirante.
   REMARQUE : N’utilisez pas de membrane respirante. Cela provoque l’évaporation du milieu de culture.
4. Cultivez la culture d’expansion. Placez la plaque scellée à 24 puits profonds dans un incubateur secouant à 50 °C, 200 tr/min pendant 24 heures.
5. Sous-culture pour la validation de la fermentation. Après 24 heures, transférez 200 μL de culture de chaque puits dans une plaque fraîche de 24 puits profonds contenant 1,8 mL de milieu de fermentation (10 % v/v inoculum). Ajoutez du CaCO₃ stérile à une concentration finale de 4 % (p/v) dans chaque puits avant l’inoculation pour tamponner le pH.
6. Incluez des commandes. Dans chaque nouvelle plaque de 24 puits profonds, remplir trois puits sélectionnés au hasard avec la souche parentale ATCC 7050 comme témoins négatifs. Traitez-les de manière identique aux souches candidates.
7. Scellez la plaque profonde à 24 puits avec une membrane non respirante.
8. Incubez la plaque profonde de 24 puits. Placez la plaque scellée dans un incubateur à secouement à 50 °C, 200 tr/min pendant 24 heures.
9. Préparez des échantillons pour la détection du lactate. Centrifugez la plaque à 5 842 × g pendant 10 minutes. Transférer 10 μL du surnageant sur une microplaque noire à 96 puits et diluer avec 990 μL d’eau ultrapure. Mélangez bien.
10. Ajoutez le capteur de lactate. Ajoutez 100 μL de l’échantillon dilué à chaque puits d’une plaque noire fraîche de 96 puits. Ajoutez ensuite 100 μL du capteur d’acide lactique. Mélangez doucement.
11. Mesurez la fluorescence. Incubez l’assiette à température ambiante pendant 5 minutes (à l’abri de la lumière). Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques avec excitation à 485 nm et émission à 515 nm.
12. Fixez le seuil de sélection des coups. Calculez la fluorescence moyenne des trois puits de contrôle parentaux (parent) et l’écart-type (SD_parent). Définissons le seuil comme F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identifiez les premiers résultats. Une souche candidate est considérée comme un coup primaire si son signal de fluorescence dépasse le seuil. Notez le nombre de résultats principaux pour validation en aval.

10. Validation secondaire des souches à haut rendement

ATTENTION : La phase mobile contient de l’acide sulfurique dilué (5 mM), qui est corrosif. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Portez un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire, lunettes de sécurité). Préparez et manipulez la phase mobile dans un espace bien ventilé ou une hotte à fumée. Collectez tous les déchets contenant de l’acide dans un contenant dédié pour une élimination correcte. Ne versez pas dans l’évier.

1. Préparez la culture de graines. Tracez les premières souches de frappe sur les plaques d’agar du milieu de graines. Incubez à 50 °C pendant 24 heures. Choisissez une colonie unique de chaque plaque et inoculez-la dans 30 mL de milieu liquide pour semencer dans une flasque de 250 mL. Incubez à 50 °C, 200 tr/min pendant 12 heures.
2. Prépare la fermentation. Préparez le milieu de fermentation et ajoutez de la poudre stérile de CaCO3 à une concentration finale de 4 % (p/v) comme neutralisateur de pH. Transférez 5 mL de la culture de semences dans 45 mL de ce milieu dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL (inocule v/v à 10 % ; volume de travail final 50 mL).
   REMARQUE : Utilisez trois flasques indépendantes pour chaque souche candidate et pour la souche parentale ATCC 7050 comme témoin.
3. Incubez les fioles. Placez les flasques dans un incubateur secouant à 50 °C, 200 tr/min. Fermentez pendant 24 heures.
4. Collectez des échantillons. Après 24 heures, prélevez 1 mL de culture de chaque flasque. Centrifugeuse à 13 800 × g pendant 2 minutes. Diluez le surnageant 100 fois avec de l’eau ultrapure et filtrez à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
5. Installez des conditions HPLC. Utilisez une colonne Aminex HPX-87H. Préparer la phase mobile : 5 mM H₂SO₄ dans de l’eau ultrapure, filtrer par une membrane de 0,22 μm, et dégazer par sonication. Réglez la température de colonne à 40 °C, le débit à 0,6 mL/min, le volume d’injection à 20 μL et le temps de fonctionnement à 20 min par échantillon (l’acide lactique élue à ~12,600 min). Utilisez un détecteur d’indice de réfraction (RID).
6. Préparez la courbe standard. Dissoudre le L-lactate de calcium dans de l’eau ultrapure pour préparer des solutions standard de 0, 0,4, 0,8, 1,2 et 1,6 g/L (exprimées sous forme de L-lactate calcique). Injectez chaque standard en triple exemplaire.
   REMARQUE : Tracez la surface maximale par rapport à la concentration et obtenez l’équation de régression linéaire (R² > 0,999). Exécutez des standards au début et à la fin de chaque lot d’échantillons pour corriger la dérive.
7. Injectez les échantillons. Injectez les surnatants filtrés de fermentation (20 μL) dans le système HPLC. Notez la zone de pic pour le pic du L-lactate de calcium.
   REMARQUE : Injectez un échantillon de contrôle qualité (1 g/L de L-lactate calcique) tous les 10 échantillons pour surveiller la stabilité du système. Le décalage de temps de rétention acceptable est de <0,2 min et la variation de la zone de pic <5 % par rapport à la norme d’étalonnage initiale.
8. Calculez le rendement de l’acide L-lactique. Interpolez la surface maximale de chaque échantillon dans la courbe standard pour obtenir la concentration de calcium L-lactate (g/L).
   REMARQUE : Convertir en concentration d’acide L-lactique en utilisant le rapport de poids moléculaire :
   (3)
   Calculez le pourcentage d’amélioration :
   (4)
9. Identifiez les dernières souches à haut rendement. Sélectionnez les souches qui présentent systématiquement un rendement d’acide L-lactique plus élevé que la souche parentale comme mutants validés. Choisissez le meilleur interprète pour une caractérisation plus approfondie.

11. Évaluation de la stabilité génétique des souches à haut rendement

1. Tracez la souche mutant sélectionnée sur des plaques d’agar de milieu de graine. Incubez à 50 °C pendant 24 heures. C’est la première génération.
2. Prenez une colonie unique de la plaque de génération 1 et inoculez-la dans 5 mL de milieu liquide à graines dans un tube de 50 mL. Incubez à 50 °C, 200 tr/min pendant 12 heures pour obtenir la culture de semences F1.
3. Transférer 10 % (v/v) de la culture de graines de génération 1 dans 50 mL de milieu de fermentation (contenant 4 % de CaCO₃ stérile) dans une fiole de 250 mL de secouement. Incubez à 50 °C, 200 tr/min pendant 24 heures.
4. Collectez 1 mL de culture après la fermentation. Centrifugez à 13 800 × g pendant 2 minutes, diluez le surnageant 100 fois avec de l’eau ultrapure, et mesurez la concentration d’acide L-lactique par HPLC. Utilisez trois fioles indépendantes pour chaque génération.
5. Pour obtenir la génération suivante, rayez une boucle de culture de première génération sur une plaque d’agar de milieu de graine fraîche. Incubez à 50 °C pendant 24 heures. Répétez les étapes 11.2 et 11.3 pour la génération 2.
6. Répétez le processus de subculture pour obtenir la génération 3 et la génération 4. Pour chaque génération, préparez trois flasques à secouer et mesurez la production d’acide lactique par HPLC.
7. Comparez les rendements des quatre générations (1–4) à l’aide d’un ANOVA unidirectionnel ou du test t de Student. La souche est considérée comme génétiquement stable si aucune différence significative (p > 0,05) dans la production d’acide lactique n’est observée entre les générations.

Résultats

Basé sur la plateforme microfluidique automatisée des goutteles, un modèle de criblage à haut débit a été mis en place. Une bibliothèque mutante de B. coagulans a été construite par mutagenèse ARTP avec un temps d’irradiation optimal de 20 s, ce qui a donné un taux de létalité d’environ 90 % (Figure 4A). Les cellules mutantes ont ensuite été encapsulées en gouttelettes de 14 pL, d’environ 30 μm de diamètre, à un débit de génération de 1500 Hz (

Discussion

Ce protocole présente un flux de travail standardisé pour le dépistage microbien industriel basé sur une plateforme microfluidique automatisée de gouttelettes. Le flux de travail intégré comprend la construction de bibliothèques mutantes, la génération de gouttelettes et l’encapsulation par cellules uniques, la culture par micro-réacteur, l’injection de biocapteurs, le tri des gouttelettes activées par fluorescence et la validation finale des souches cibles. En utilisant un criblage à ha...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Pour la préparation de plaques solides
Éthanol anhydre	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Essuyer et désinfecter les bancs et les appareils de laboratoire
Plasma atmosphérique et à température ambiante (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  a été utilisé pour construire la bibliothèque de mutants pour la mutagenèse des souches.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 a été utilisé comme souche de départ pour la mutagenèse et comme cible du criblage par gouttelettes à haut débit.
Microplaque noire (96 puits)	Corning	3925	La microplaque noire à 96 puits a été utilisée pour les essais de capteur de lactate et la détermination de la concentration d'acide lactique.
Carbonate de calcium	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Pour isoler les hyperproducteurs d'acide L-lactique.
Chlorure de calcium	Sinopharm	10005819	Le chlorure de calcium est utilisé pour la préparation du milieu de culture microbien, fournissant des nutriments essentiels pour la croissance microbienne.
Lactate de calcium L-	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Utilisé comme échantillons pour la préparation de la courbe standard dans le processus de détection.
Tube de centrifugation (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Utilisé pour la dilution du liquide bactérien
Tube de recueil	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Pour recueillir les gouttelettes et la culture subséquente
Ordinateur	Lenovo	E450	Installation du logiciel et contrôle de DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	Pour la coloration des cellules.
Plaque à puits profonds (24 puits)	BKMAMLAB	110424008	Pour la vérification initiale du rendement des mutants de B. coagulans à l'aide de plaques à puits profonds
Démulsifiant (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	Le démulsifiant pour gouttelettes est utilisé pour briser les microgouttes eau-dans-huile et libérer les cellules, les souches ou le surnageant internes pour la détection et l'analyse ultérieures.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose est utilisé pour la préparation du milieu de culture microbien, fournissant des nutriments essentiels pour la croissance microbienne.
Citrate d'hydrogène diammonium	Solarbio	D9950	Le citrate d'hydrogène diammonium est utilisé pour la préparation du milieu de culture microbien, fournissant des nutriments essentiels pour la croissance microbienne.
Phosphate dipotassique d'hydrogène anhydre	Sigma-Aldrich	P8281	Le phosphate dipotassique d'hydrogène anhydre est utilisé pour la préparation du milieu de culture microbien, fournissant des nutriments essentiels pour la croissance microbienne.
Version du logiciel DREM	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Pour le contrôle de l'instrument DREM Cell.Le logiciel DREM est un programme commercial exclusif exclusivement pour l'instrument DREM Cell de Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Il n'a pas d'accès officiel public ou d'URL de téléchargement et n'est distribué qu'avec l'instrument sous autorisation.
Trieur de cellules microfluidiques à microgouttes piégées (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Il a été utilisé pour l'encapsulation et le tri de cellules uniques à haut débit afin de cribler rapidement les souches à haut rendement à partir de la bibliothèque de mutants.
Puce de génération de gouttelettes	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	La puce de génération de gouttelettes est utilisée pour produire des gouttelettes monodisperses à l'échelle du picolitre (pL) pour l'encapsulation de cellules uniques.
Puce d'injection de gouttelettes	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	La puce d'injection micro de gouttelettes est utilisée pour réaliser une injection précise et trace de réactifs dans les gouttelettes préformées pour les réactions biochimiques subséquentes.
Puce de tri de gouttelettes	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	La puce de tri de gouttelettes est utilisée pour trier les gouttelettes cibles contenant des cellules à haut rendement en fonction des signaux de fluorescence.
Flacon de secouage Erlenmeyer (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Utilisé pour la vérification de culture à l'échelle de la souche mutante B. coagulans après un criblage primaire avec des plaques à puits profonds, afin de confirmer la stabilité et la reproductibilité des souches à haut rendement.
Mémoires filtrantes (0,22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Utilisé pour la filtration du bouillon de fermentation.
Microscope inversé à fluorescence	Olympus	IX73	Le microscope inversé à fluorescence Olympus IX73 a été utilisé pour observer la morphologie bactérienne dans les gouttelettes
Huile fluorée	Bio-Rad	1864006	L'huile fluorée sert de phase continue dans la microfluidique goutte à goutte pour générer des microgouttes eau-dans-huile stables, monodisperses et non interférentes, permettant la culture et le criblage de cellules uniques.
Colonne de chromatographie liquide haute performance	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Elle est utilisée pour séparer l'acide lactique des autres composants du bouillon de fermentation en fonction de leurs différentes propriétés de rétention, afin de réaliser la détection quantitative précise de l'acide lactique.
Chromatographie liquide haute performance	Shimadzu	228-34001-02	HPLC est utilisé pour la détection quantitative et l'analyse de l'acide L-lactique dans les échantillons de fermentation.
Tube d'injection	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Pour l'injection de la phase huileuse, de la suspension bactérienne échantillon et de la solution de réactif
Sulfate de fer(III) heptahydraté	Sulfate de fer(III) heptahydraté	Sulfate de fer(III) heptahydraté	Sulfate de fer(III) heptahydraté
Cabine d'écoulement