Protocoles pour l’élevage efficace et l’analyse fonctionnelle de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster

Résumé

L’objectif de ce protocole est de faciliter l’analyse fonctionnelle des interactions parasitoïde–hôte chez Asobara japonica et Drosophila melanogaster. Grâce à des méthodes d’élevage optimisées, un test d’infection à ovoposition unique et un knockdown génétique médié par l’ARNi.

Résumé

Le parasitisme est une interaction biologique dans laquelle un organisme exploite le corps ou les ressources d’un autre (l’hôte), entraînant des dommages importants ou la mort de l’hôte. Parmi les animaux parasites, les guêpes parasitoïdes sont l’une des lignées les plus riches en espèces, représentant près de 20 % de toutes les espèces d’insectes. En particulier, les guêpes endoparasitoïdes ovipositent directement dans le corps de l’hôte et déploient une grande variété de facteurs venineux pour manipuler le développement, l’immunité et la physiologie de l’hôte. En réponse à une attaque de guêpe, les hôtes tentent d’éliminer les œufs parasitoïdes par des mécanismes immunitaires innés. Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les composants du venin individuels modulent la biologie de l’hôte et favorisent un parasitisme efficace restent peu compris. Ici, nous décrivons un protocole de laboratoire standardisé pour l’élevage de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica et de son hôte Drosophila melanogaster. Des souches parthénogénétiques et sexuées d’A. japonica sont disponibles, et la souche parthénogénétique présente un taux de réussite parasitaire élevé, permettant un maintien stable des stocks de laboratoire pour l’analyse du génome et les tests de parasitisme. Un test d’infection à ovoposition simple et une méthode de knockdown génétique à double brin à base d’ARN ont été optimisés pour l’analyse fonctionnelle des gènes venineux. Ensemble, ces protocoles fournissent un cadre expérimental pratique pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions parasitoïde-hôte et faciliteront les recherches futures en biologie du développement, immunologie et physiologie.

Introduction

Le parasitisme est un mode de vie dans lequel un organisme exploite les ressources nutritionnelles d’un autre et est répandu dans tous les taxons. On estime que jusqu’à la moitié de tous les organismes connus présentent du parasitisme au cours de leur cycle^{de vie 1}. Parmi les parasites, les guêpes parasitoïdes constituent un groupe particulièrement diversifié, représentant environ 20 % de tous les^{insectes 2}. Ils exploitent une large gamme d’hôtes arthropodes, tels que les insectes, les araignées et les acariens, et présentent une diversité remarquable dans leur cycle de vie et leurs stratégies^{parasitaires 3}. Ces caractéristiques font des guêpes parasitoïdes l’un des groupes d’insectes les plus réussis sur le plan évolutif et écologique.

Les interactions entre parasitoïdes et leurs hôtes ont été largement étudiées comme systèmes modèles de « courses aux armements » évolutives. En particulier, les guêpes endoparasitoïdes utilisent une grande variété de facteurs, notamment les venins, les virus symbiotiques et les^{tératocytes 4,5}. Ces facteurs manipulent la physiologie et le développement de l’hôte, assurant ainsi un développement réussi au sein de l’hôte. Malgré ces avancées, les mécanismes moléculaires sous-jacents au parasitisme restent mal compris chez la plupart des espèces parasitoïdes. Une limitation majeure est leur petite taille corporelle, ce qui a entravé l’identification biochimique des composants du venin. De plus, il est techniquement difficile de maintenir les parasitoïdes et leurs hôtes avec des stades de développement synchronisés en conditions de laboratoire.

Les avancées récentes dans le séquençage de nouvelle génération et d’autres technologies omiques permettent désormais des analyses à l’échelle du génome, même chez de très petites espèces parasitoïdes. Ces approches ont ouvert de nouvelles voies pour étudier des mécanismes moléculaires auparavant inaccessibles, permettant d’étudier les interactions parasitoïde-hôte à une résolution sans précédent. Dans ce contexte, notre laboratoire se concentre sur Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera : Braconidae), une espèce initialement identifiée au^{Japon 6,7,8}. A. japonica comprend une souche parthénogénétique thelytokous, dans laquelle les femelles produisent une descendance sans accouplement. Cette caractéristique nous permet de collecter des quantités substantielles d’ADN génomique génétiquement uniforme pour le séquençage du génome^{entier 9}. De plus, cette espèce parasite un large éventail d’espèces de Drosophila, y compris l’organisme modèle D. melanogaster,  qui offre d’importants avantages expérimentaux grâce à ses conditions d’élevage bien établies et à des stades de développement précisément définis, permettant des tests d’infection reproductibles et un contrôle précis du développement^{parasitoïde 10}.

Lors du parasitisme d’A. japonica, une guêpe femelle injecte du venin avec un œuf unique dans une larve de mouche, à l’intérieur duquel une larve de guêpe pousse aux côtés de son hôte. Notamment, A. japonica présente un taux de réussite de parasitisme élevé sur l’hôte D. melanogaster, faisant de ce couple parasitoïde-hôte un modèle expérimental puissant. Ici, nous décrivons les protocoles pour un élevage stable, un test d’infection à oviposition simple, et une méthode de knockdown génétique basée sur l’ARN double brin (dsRNA) chez A. japonica. Ces protocoles fournissent un cadre fiable pour disséquer les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions parasitoïde-hôte.

Protocole

Un aperçu schématique de la méthode d’élevage synchronisé pour D. melanogaster et A. japonica est présenté à la Figure 1.

1. Élevage de la mouche hôte Drosophila melanogaster en laboratoire

1. Maintenez tous les animaux d’expérimentation à 25 °C et une humidité relative de 50-60 % selon un cycle clair/obscurité de 12:12. Utilisez la souche sauvage Oregon-R (OR) comme hôte pour A. japonica (Figure 2A).
2. Transférer les mouches adultes dans un nouveau flacon alimentaire contenant un milieu standard de semoule de maïs, levure et agar (0,55 % d’agar, Tableau 1). Étiquetez le flacon avec la date de transfert et le nom de la souche « OR ».
3. Éliminez ces mouches adultes un jour après le transfert pour éviter un nombre excessif d’œufs dans la nourriture. Assurez-vous que les larves de la progéniture se nourrissent à la surface de la nourriture.
   REMARQUE : À titre de recommandation, maintenez environ 200 à 250 œufs par flacon alimentaire (φ30×100 mm). Des densités d’œufs plus élevées peuvent réduire le succès du parasitisme et augmenter la variation du développement de l’hôte et des guêpes.
4. Quatre jours après l’étape 1.2, transférez une cuillerée de larves de mouches (4 jours après la ponte, dAEL) dans un nouveau flacon alimentaire. Gardez ces larves à l’écart des parasitoïdes pour la prochaine génération. Cette procédure aide également à contrôler la densité larvaire de l’hôte dans un flacon.

2. Élevage de la guêpe endoparasitoïde Asobara japonica en laboratoire

1. Utilisez une souche partenogénétique Tokyo (TK) et une souche sexuelle Iriomote-jima (IR) (Figure 2B). La première est composée de femmes, tandis que la seconde est composée de femmes et de mâles. Les mâles émettent deux à quatre jours avant les femelles. Par conséquent, confirmez la présence des femelles par leurs ovipositeurs avant le transfert.
2. Transférez 10 à 20 guêpes adultes directement du flacon de stock vers le flacon contenant des larves de mouches à 4 dAEL. Étiquetez le flacon avec la date de transfert et le nom de la souche « TK » ou « IR ». Maintenez les guêpes dans les mêmes conditions que l’étape 1.1.
3. Laissez les guêpes adultes pondre des œufs dans les larves de mouches. Éliminez ces guêpes un à deux jours plus tard pour éviter le superparasitisme, qui peut entraîner la mort de l’hôte. Retirez les mouches adultes éclosées qui ont échappé au parasitisme 10 jours ou plus après l’étape 2.2.
4. Deux semaines après l’étape 2.2, les guêpes adultes commencent à s’écloquer de la pupe de la mouche hôte. Transférez ces guêpes adultes nouvellement fermées dans un nouveau flacon contenant du papier filtre contenant 25 % de glucose et une solution de 50 mM de vitamine C. Les feuilles de papier filtre doivent être stérilisées à 130 °C pendant 2 heures. Fournir la solution sur du papier filtre favorise les comportements d’oviposition et prolonge la durée de vie des guêpes adultes. Notre approche pour utiliser la vitamine C afin d’améliorer l’oviposition a été inspirée par les observations des études sur Drosophila ¹¹.

3. Essai d’infection à oviposition simple

1. Synchronisez le stade de développement des larves de mouches utilisées pour l’expérience d’infection.
   1. Placez les mouches adultes dans un tube de 50 mL contenant une assiette d’agar de jus de raisin (3 % d’agar) tartinée de pâte de levure fraîche et laissez-les pondre pendant 24 heures.
   2. Collectez les larves de premier stade fraîchement écloses sur l’assiette d’agar de jus de raisin et transférez-les dans un petit flacon (12 mL) contenant 2 à 3 g de pâte alimentaire pour mouches (nourriture pour mouches mélangée à une quantité appropriée d’eau). 20 à 30 larves sont placées dans le flacon. Les larves de mouches sont laissées croître à 25 °C.
2. Au moment opportun, préparez une boîte de Petri de 4 cm contenant une fine couche uniforme de pâte alimentaire pour mouches couvrant une zone d’environ 1,5 à 2,0 cm de diamètre (ci-après appelée arène d’analyse d’infection). En plus de l’arène d’analyse d’infection, préparez un nouveau petit flacon (12 mL) contenant une quantité appropriée de pâte alimentaire pour mouches. Ce flacon est utilisé pour élever les larves hôtes après le test d’infection.
3. Collecter les larves à étages et les transférer dans un plat contenant de l’eau déionisée (résistivité = 15 MΩ·cm, 25 °C). Rincez les larves dans la gamelle avec une agitation douce pour éliminer les résidus de nourriture de leur corps.
4. Après rinçage, retirez doucement l’excès d’humidité des larves à l’aide de lingettes en papier sans peluches, car l’excès d’eau interfère avec le comportement d’oviposition des guêpes dans l’arène du test d’infection. Ensuite, transférez les larves dans l’arène. Cette étape augmente l’activité larvaire pendant l’expérience d’infection.
5. Anesthésiez les guêpes adultes avec du gaz CO₂ à un débit de 5 L·^min-1 et une pression de 0,2 MPa. Ensuite, placez doucement environ trois femelles guêpes dans l’arène du test d’infection. Fermez le couvercle du plat et laissez-les récupérer sur la pâte de mouches.
6. Observez le comportement d’oviposition de ces guêpes sous un stéréomicroscope (zoom : 10× à 15×).
   REMARQUE : Lorsqu’une guêpe touche le corps larvaire d’une mouche en mouvement, elle insère rapidement son ovipositeur dans le corps de la mouche et injecte des composants venineux. Bien que la larve de mouche se tord et se débatte sur son corps, elle devient immédiatement paralysée. Par la suite, la guêpe fait vibrer son abdomen et dépose un œuf dans le corps larvaire de l’hôte, après quoi l’ovipositeur est retiré. Ce comportement d’oviposition est appelé infection.
7. Après l’infection, ouvrez le couvercle et transférez la larve de mouches infectée dans le nouveau petit flacon contenant de la pâte alimentaire préparée à l’étape 3.2. Pour standardiser le moment de l’infection, réalisez l’expérience d’infection dans les 15 minutes.
8. Étiquetez le petit flacon avec des informations expérimentales, telles que la date, le nom de l’échantillon, l’heure d’infection et le nombre d’individus. Ces fioles sont bouchées puis placées dans un récipient humide et conservées à 25 °C.

4. Génération de guêpes par interférence ARN (ARNi) par injection dsRNA

1. Synthétiser des dsRNA de 400 pb ou plus pour un knockdown génique médié par dsRNA (interférence ARN, ARNi) à l’aide d’un système de synthèse dsRNA basé sur la transcription in vitro . Les échantillons dsRNA doivent être maintenus à -20 à -80 °C jusqu’à utilisation. Les protocoles détaillés sont ceux décrits précédemment⁹.
2. Préparez une boîte de Petri de 5,5 cm contenant 2 % d’agar pour placer les corps des guêpes. Remplissez les deux tiers de chaque plat d’agar pour générer une épaisse couche de plaque d’agar pour l’injection.
3. Placez une lingette en papier sans peluches, humidifiée à l’eau, sur le couvercle d’un plat en plastique.
4. Collectez les chrysalides de mouches hôtes 7 jours après l’infection (dpi) à partir du flacon et placez-les sur les lingettes en papier sans peluche préparées à l’étape 4.3. Ajouter une goutte d’eau à la paroi du flacon aide à détacher les chrysalides de mouches hôtes du flacon.
5. Sous le stéréomicroscope (zoom : 20×), retirez la pupe de la mouche hôte et exposez le corps de la guêpe avec une pince. À 7 dpi, la plupart des guêpes sont au stade nymphal, où la tête, le thorax et l’abdomen sont distincts. Le corps d’une guêpe est immobile.
6. Placez les corps de guêpes récupérés sur la plaque d’agar préparée à l’étape 4.2, en alignant leurs axes corporels dans la même orientation. Disposez 20 à 30 corps de guêpes avec leur côté dorsal vers le haut en une à deux lignes. Enlevez l’excès d’humidité sur la plaque d’agar à l’aide d’une lingette en papier sans peluches pour éviter que les guêpes ne glissent.
7. Suivant les instructions du fabricant, installez l’appareil d’injection et le stéréomicroscope (Figure 3A). Utilisez un système de microinjection équipé d’une aiguille capillaire en verre qui permet un contrôle précis du volume et de la vitesse d’injection. Placez la plaque d’agar dans laquelle les têtes de la guêpe sont orientées vers la pointe de l’aiguille d’injection. Le volume d’injection est de 50 nL·^wasp-1 et la vitesse d’injection est de 50 nL·^sec-1 sur l’injecteur.
8. Préparez des aiguilles capillaires en verre à l’aide d’un extracteur d’aiguilles. La forme du capillaire en verre est réglée avec la température du chauffage.
9. Placez l’aiguille capillaire en verre sur le meuleur à aiguilles à un angle de 30-35°. Meuler l’aiguille jusqu’à ce que la longueur de la pointe atteigne 0,04 mm (quatre divisions sur le réticule de l’oculaire, Figure 3B).
10. Juste avant l’injection, décongelez l’ARNd. La concentration dsRNA est de 0,25-1 μg·^μL-1. Pour visualisation, la solution dsRNA est colorée avec un colorant bleu (sel disodium d’Erioglaucine, 2 % poids-volume-1). À l’aide d’une pointe de pipette microchargeuse, remplissez le capillaire en verre avec une solution dsRNA avec un colorant bleu. 4 μL suffisent pour injecter 30 corps de guêpes. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente à l’intérieur de la solution.
    REMARQUE : Après avoir chargé la solution dsRNA, tapotez doucement le côté de l’aiguille avec un ongle pour éliminer les bulles d’air emprisonnées. Les bulles d’air résiduelles peuvent obstruer le flux de la solution et interférer avec une injection réussie.
11. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille, remplissez la partie libre du capillaire en verre d’huile minérale, afin de veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne reste à l’intérieur du capillaire.
12. Fixez l’aiguille capillaire en verre contenant la solution dsRNA et l’huile minérale sur le porte-aiguille, puis montez-la sur le dispositif d’injection.
13. Ajustez la position de la plaque d’agar et de l’aiguille capillaire en verre sur l’injecteur, de sorte que l’aiguille en verre soit positionnée à un angle de 30 à 45° par rapport aux corps de la guêpe (Figure 3A).
14. Insérez l’aiguille capillaire en verre dans le côté dorsal du corps de la guêpe, avec le côté légèrement latéral par rapport à la ligne médiane dorsale. Microinjectez la solution dsRNA à l’intérieur du corps. La solution dsRNA injectée est visible avec un colorant  bleu (Figure 3C).
15. Après l’injection, placez les plaques d’agar dans un récipient humide (70-80 % d’humidité relative) et maintenez-les dans un incubateur à 25 °C pendant une semaine, jusqu’à la naissance des guêpes adultes. Les corps de guêpes blessés doivent être retirés de la plaque d’agar pour éviter toute contamination bactérienne.
    POINT DE PAUSE : À l’étape 4.6, les chrysalides de la guêpe peuvent être maintenues sur la plaque d’agar pendant plusieurs heures avant l’injection. Les aiguilles peuvent être préparées à l’avance (Étapes 4.8 et 4.9) ; Cependant, elles ont tendance à se boucher avec le temps. Les aiguilles fraîchement préparées offrent généralement une performance d’injection plus fiable.

Résultats

Les souches asexuées et sexuelles d’Asobara japonica
A. japonica est largement répandue à travers le Japon. Les souches parthénogénétiques de Thelytokous prédominent dans les îles principales, tandis que les souches sexuelles d’Arrhenotokous se trouvent dans les îles subtropicales, notamment les îles Amami-Oshima et Iriomote-jima ^8,12. Dans les souches sexuées, les mâles émergent quelques jo...

Discussion

Dans cette étude, nous avons mis en place une plateforme expérimentale polyvalente pour étudier les interactions parasitoïde-hôte au niveau moléculaire. En optimisant les conditions d’élevage, un test d’infection à oviposition unique et le protocole ARNi, nous fournissons un système robuste pour les études fonctionnelles de facteurs dérivés des parasitoïdes. Cette plateforme facilitera de futures études visant à découvrir les mécanismes par lesquels les guêpes parasitoïdes manipulent le ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infection assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injection
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infection assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injection
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Rearing
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infection assay
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Image analysis
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Rearing
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Nuclei staining, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infection assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injection
Fiji	NA	https://fiji.sc	Image analysis
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Rearing
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Rearing
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Rearing
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Sample storage
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Sample storage
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infection assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Rearing
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthesis
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Rearing
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthesis
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	dsRNA injection
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injection
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injection
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthesis
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Rearing
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infection assay
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infection assay
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Rearing
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injection
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infection assay
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Rearing
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infection assay
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Rearing