Mesure Caenorhabditis elegans sur des milieux solides

Afin de mesurer la durée de vie chez C. elegans, une population âgée synchronisée est générée par ponte contrôlée dans le temps. Des vers hermaphrodites adultes actifs sont transférés sur des boîtes de milieu de croissance pour nématodes ensemencées avec des E. coli inactivés par UV, laissés pour pondre des œufs pendant six à huit heures, puis retirés. Au cours des deux jours suivants, les vers éclosent de ces œufs et se développent jusqu'au stade larvaire L4. Les vers au stade L4 sont transférés sur de nouvelles boîtes de milieu NGM contenant de l'ampicilline afin d'éviter toute contamination bactérienne vivante, ainsi que du FUDR pour empêcher la reproduction, et sont laissés se développer en adultes.

À partir de ce moment, les vers adultes sont observés tous les deux ou trois jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts. À chaque point temporel, les vers morts sont retirés de la boîte et le nombre de vers vivants et morts est enregistré. Je suis George Seton du laboratoire de Matt Capline du Département d'anatomie pathologique de l'Université de Washington.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mesurer la durée de vie et observer notre élégance en matière d'hépatite. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la génétique du vieillissement. Commençons donc.

Une expérience de base sur la durée de vie nécessite deux types de boîtes, les boîtes NGM standard, qui ne contiennent aucun additif, et les boîtes AMP FUDR, auxquelles on a ajouté de l'ampicilline et de la fluorodésoxyuridine au NGM. Les deux types de boîtes sont ensemencés avec des bactéries e coli OP 50, qui sont ensuite inactivées par exposition aux rayons UV. Commencez par préparer 10 millilitres de solution NGM.

Pour chaque boîte de Pétri de 60 millimètres, faire fondre complètement le milieu NGM solide au four à micro-ondes à puissance maximale en impulsions de 32 secondes. Agiter doucement le milieu entre chaque impulsion afin d'éviter l'accumulation de bulles de gaz sous pression, puis placer le milieu liquide dans un bain-marie à 55 degrés Celsius ou sur la paillasse pour permettre son refroidissement. Une fois que le milieu a refroidi à 55 degrés Celsius, température à laquelle vous devez pouvoir tenir le récipient en verre à main nue sans gêne, il est prêt à recevoir les médicaments.

Et pour couler les boîtes destinées aux boîtes contenant des médicaments, ajouter 33 microlitres de FUDR à 150 millimolaire et 100 microlitres d'ampicilline à 100 milligrammes par millilitre par 100 millilitres de NGM, puis agiter doucement pour homogénéiser. L'ampicilline est utilisée pour prévenir la contamination bactérienne étrangère et le FUDR pour empêcher les œufs de éclore, de sorte que les vers n'auront pas besoin d'être transférés tous les quelques jours afin de les séparer des larves en croissance.

Versez maintenant le milieu et laissez les boîtes sécher sur la paillasse pendant deux jours. La veille de la fin du séchage des boîtes, préparez une culture liquide en milieu LB à partir d'une colonie isolée provenant d'un isolement récent d'Escherichia coli OP50 sur gélose LB. Préparez au moins 0,5 millilitre de culture par boîte de 60 millimètres.

Placer la culture OP 50 dans un agitateur à 37 degrés Celsius et laisser les bactéries croître toute la nuit. Le jour suivant, former un culot des bactéries OP 50 par centrifugation à 3 500 g pendant 10 minutes. Jeter suffisamment de surnageant pour resuspendre les bactéries à une concentration 10 x.

Ensuite, inoculez chaque plaque avec 100 microlitres de la culture concentrée. Évitez de toucher la surface de l'NGM avec la pointe de la pipette, car les imperfections de la surface du milieu permettraient aux vers de s'enfouir. Tournez les plaques en vortex jusqu'à ce que les bactéries recouvrent la zone centrale de l'NGM sans s'approcher des parois de la plaque, puis laissez les plaques sécher sur la paillasse pendant 24 heures. Une fois sèches, exposez la surface des plaques à une dose de rayons UV suffisamment élevée pour arrêter la croissance bactérienne ; nous utilisons un appareil Strata Gene UV Straddle Linker 2, 400.

Commencez par charger les plaques dans le lien latéral sans leurs couvercles. Appuyez maintenant sur énergie. Saisissez 9 9 9 9 sur le clavier numérique et appuyez sur démarrer.

Les plaques seront exposées aux UV pendant environ cinq minutes. Les plaques contenant des bactéries tuées par les UV peuvent être conservées à l’envers à quatre degrés Celsius pendant jusqu’à un mois. Cette section décrit comment générer une population de vers ayant une date d’éclosion commune.

Commencez par transférer environ 20 vers adultes jeunes sur une plaque NGM fraîche sans médicament. Laissez la plaque à 25 degrés Celsius pendant environ une semaine afin de permettre aux vers de se multiplier et de consommer toute la nourriture bactérienne en une semaine. Des vers nouvellement éclos, bloqués en croissance au stade dauer, devraient apparaître ; transférez alors 20 à 30 larves dauer sur une plaque NGM fraîche sans médicament et incubez-les à 25 degrés Celsius en présence de nourriture.

Les larves dauer deviendront des adultes reproductifs en deux jours et resteront reproductivement actifs pendant quelques jours supplémentaires. Transférez maintenant 10 à 15 adultes reproductifs sur une plaque NGM fraîche sans drogue. Cette plaque est appelée plaque de ponte synchronisée ou plaque TEL.

Laisser la boîte TEL à 25 degrés Celsius afin que les vers puissent pondre des œufs. Les animaux éclos de ces œufs seront les animaux expérimentaux et leur durée de vie sera évaluée après six heures. Examiner la boîte TEL à la recherche d'œufs.

S'il n'y a pas encore suffisamment d'œufs, laisser la boîte TEL à 25 degrés Celsius pendant un maximum de 24 heures au total. Vérifier périodiquement la présence d'œufs. Lorsqu'un nombre suffisant d'œufs a été pondu, retirer les adultes de la boîte TEL.

Une expérience typique d’espérance de vie nécessite de 30 à 90 œufs par groupe expérimental, mais plusieurs centaines d’œufs peuvent être produits sur une seule plaque TEL. Environ 150 œufs sont pondus par 10 à 15 adultes reproducteurs actifs en six à huit heures. Lors de la comparaison de groupes expérimentaux, une signification statistique peut être obtenue pour de grandes différences d’espérance de vie avec seulement 30 animaux.

Un plus grand nombre d'animaux devrait être utilisé pour distinguer des différences plus subtiles. Placez maintenant la boîte TEL sans adultes à 20 degrés Celsius jusqu'à ce que les œufs éclosent et que les vers aient atteint le stade larvaire L4. Cela prend généralement deux jours pour le type sauvage C. elegans, mais peut prendre plus de temps pour les souches présentant des phénotypes de développement lent.

Cette section décrit comment suivre le cycle vital d'une population synchronisée par âge. Transférez d'abord les larves L4 de la boîte TEL vers des boîtes AMP FUDR disposées à plat. Pour chaque souche ou condition testée, il est habituel de préparer deux à trois boîtes avec 25 à 30 vers par boîte.

Incuber les boîtes de gélose AMP FUDR à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, examiner visuellement les vers, le milieu et les bactéries, puis transférer les vers sur des boîtes de gélose AMP FUDR fraîches. Si les vers ont consommé la majeure partie de la nourriture bactérienne, cela se produit généralement une à deux fois par semaine.

Au début de l'expérience, si un nombre important de larves est présent, cela indique généralement que les vers ont été transférés sur les plaques AMP FUDR au stade adulte jeune plutôt qu'au stade L4. Les adultes jeunes peuvent pondre des œufs avant que le FUDR n'agisse, et occasionnellement, certaines larves échappent aux effets du FUDR et se développent en adultes. Ces larves faussent l'expérience dans cette situation ; transférez les vers adultes sur des plaques fraîches et jetez les anciennes plaques contenant les larves.

Les vers doivent également être transférés sur des boîtes fraîches s'il y a présence de bactéries vivantes en croissance. Généralement, la combinaison de l'AMP et de l'irradiation UV garantit qu'aucune bactérie vivante ne contamine l'expérience, mais cela peut parfois se produire. Transférez également les vers.

Si une croissance fongique est observée sur le milieu. Si elle est détectée suffisamment tôt, la moisissure peut être retirée à l’aide d’une pipette ou d’une spatule. Une fois qu’elle atteint une taille supérieure à quelques millimètres de diamètre, il est généralement plus facile de transférer les vers vers une nouvelle boîte.

Évaluez la durée de vie de tous les vers tous les deux ou trois jours. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, déterminez si chaque ver est vivant ou mort.

Tapotez doucement la boîte. Le ver est vivant s'il bouge en réponse aux tapotements. Si le ver ne réagit pas au tapotement de la boîte, zoomez sur la région de la tête et tapez doucement sur la tête du ver avec un curet en platine.

Noter le ver comme mort. S'il ne réagit pas en bougeant la tête, retirer le ver mort de la boîte. Après avoir vérifié tous les vers, enregistrer la date ainsi que le nombre de vers vivants et morts.

Les vers maintenus sur milieu solide échappent parfois de la surface de la boîte en creusant ou en grimpant le long de la paroi. Les vers en fuite sont totalement exclus de l'étude. Une fois terminé, remettez les boîtes dans l'incubateur à 20 degrés Celsius.

Attendez encore deux à trois jours, puis vérifiez à nouveau les boîtes. Poursuivez ce protocole jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Le nombre de vers décédés chaque jour est généralement inversé pour calculer la proportion de vers vivants chaque jour ; ces données sont ensuite représentées graphiquement sous forme de courbe de survie, en tenant compte du jour de la ponte programmée.

Jour zéro. La durée de vie médiane typique pour N deux. La souche sauvage de Sea elgan maintenue sur des bactéries inactivées par UV à 20 degrés Celsius est d'environ 25 jours, mesurée à partir de l'œuf.

Nous venons de vous montrer comment mesurer la durée de vie et observer l'élégance. Vous pouvez modifier cette procédure de base pour tester une variété de conditions environnementales, notamment la restriction alimentaire et l'interférence ARN, qui est abordée dans le texte complémentaire. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.