Techniques de microinjection pour l'étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

Cette procédure commence par la collecte d'embryons sur des boîtes contenant de la gelée de jus de raisin, pendant 30 à 60 minutes. Après avoir retiré la boîte de la cage d'élevage, prélevez les embryons à l’aide d’un pinceau humide et déposez-les sur un ruban adhésif double face. Faites rouler délicatement un embryon sur le ruban à l’aide d’une moitié de pince à épiler jusqu’à ce que le chorion s’ouvre.

Prenez l'embryon et placez-le délicatement sur la lamelle. Recouvrez-le d'une couche de colle het. Répétez cette opération jusqu'à ce que vous ayez suffisamment d'embryons.

Après la déshydratation, les embryons sont prêts pour l'injection. Bonjour, je suis Ingrid Bruce Musher du laboratoire du Dr. Jonathan Sculley, du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'injecter microscopiquement des embryons syncytiaux de drosophile.

Nous utilisons cette procédure pour étudier le rôle des microtubules et des moteurs basés sur la protéine mitotique dans la mitose. Par exemple, nous micro-injectons des anticorps ou d'autres inhibiteurs de protéines mitotiques spécifiques. En analysant l'effet de l'inhibiteur sur la mitose, nous sommes en mesure de déterminer la fonction de la protéine ciblée.

Commençons. Pour commencer les préparatifs deux à trois jours avant l'expérience, installez la cage de ponte en découpant deux petits trous d'environ un centimètre carré sur des côtés opposés d'une bouteille en plastique. Boucher les trous avec un morceau de coton, afin de permettre la circulation de l'air.

Faites tomber les mouches dans la bouteille, puis recouvrez-la avec une plaque de jus de raisin. En présence de levure, maintenez la cage à mouches à température ambiante afin que les mouches pondent des œufs pendant jusqu'à 10 jours, au moins un jour avant l'expérience. Prélevez les aiguilles destinées à l'injection et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Le jour de l'expérience, préparez et chargez les aiguilles. Tout d'abord, sortez la tubuline étiquetée du congélateur et placez-la sur de la glace pendant cinq à quinze minutes. Ensuite, diluez-la avec du tampon GPEM, puis centrifugez-la de 10 à 15 minutes à 13 000 tr/min à quatre degrés Celsius.

Enfin, chargez un à deux microlitres dans l'aiguille et conservez-la à quatre degrés Celsius afin d'éviter la polymérisation induite par la température dans l'aiguille. Avant de mettre en place la lame couvre-objet, préparez une colle à heptane en enroulant du ruban adhésif double face et en le plaçant dans un flacon de 100 millilitres.

Ajoutez environ 50 millilitres d'heptane, scellez la bouteille et agitez-la pendant plusieurs jours. Avant de préparer les embryons, préparez une chambre de déshydratation dans laquelle les embryons seront placés avant l'injection. Pour ce faire, placez une partie d'une boîte de 35 millimètres à l'intérieur d'une boîte de Petri de 100 millimètres afin de former une plateforme, puis ajoutez un dessiccant, à savoir du sulfate de calcium anhydre, autour de celle-ci, de sorte que la hauteur du dessiccant ne dépasse pas celle de la plateforme, et recouvrez le tout.

Pour commencer la préparation des embryons, commencez par les recueillir à partir de la cage lacustre en changeant la plaque de jus de raisin avec de la levure chaque heure ; les embryons doivent être observés environ deux heures après le début du prélèvement. Pour préparer la lamelle, placez-la sur un côté d'une lame de microscope et fixez les quatre coins avec du ruban adhésif afin qu'elle ne bouge pas. À l'aide d'un applicateur en coton, appliquez une couche de colle à l'heptane en ligne sur la lamelle.

La colle ne doit pas être visqueuse et doit sécher en quelques secondes. Si elle est trop épaisse, ajoutez davantage d'heptane. Enfin, placez un morceau de ruban adhésif double face sur la lame, à côté du couvre-objet.

Faites glisser avec un pinceau humidifié. Ramassez délicatement les embryons depuis la plaque de jus de raisin et placez-les sur le ruban adhésif double face fixé sur la lame. Ensuite, utilisez une moitié de pince pour faire rouler les embryons sur le ruban adhésif double face jusqu'à ce que le chorion s'ouvre.

Prendre l'embryon en le faisant doucement rouler sur le Corian afin qu'il adhère à la pince, puis le placer sur la colle à heptane présente sur la lamelle. Positionner l'embryon de façon que son côté long soit parallèle au côté long de la lamelle. Placer 10 à 20 embryons en une seule rangée.

Retirez la lame couvre-objet et placez-la dans la chambre de déshydratation pendant trois à huit minutes. Le temps nécessaire dépend de l'humidité locale et de la quantité à injecter. Ensuite, placez la lame couvre-objet sur une chambre métallique munie de graisse à vide.

Enfin, recouvrez les embryons avec de l'huile de carbone halo pour éviter toute déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts pour l'injection. Commencez par localiser les embryons sous un objectif 16 x.

Déplacez les embryons et localisez l’aiguille sans modifier le plan focal. Centrez l’aiguille puis déplacez-la vers le haut sans la bouger dans les directions X ou Y. Pour ouvrir l’aiguille, insérez le bord de la lame couvre-objet dans le champ de vision, mais pas à l’endroit où se trouvera l’aiguille.

Et abaissez l’aiguille jusqu’au même plan focal. Déplacez très prudemment la lame couvre-objet jusqu’à ce qu’elle touche l’aiguille et la brise délicatement. Remontez l’aiguille.

Placez maintenant les embryons en vue. Abaissez l’aiguille dans l’huile, et veillez à obtenir de belles gouttes de liquide à l’extrémité de l’aiguille. Déplacez l’embryon vers l’aiguille, injectez-y une goutte, puis éloignez l’embryon.

Une fois que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observés au microscope confocal avec un objectif de 60 ou 100 x. Un embryon témoin doit ressembler à celui présenté dans ce film. Il s'agit d'un embryon exprimant la tubuline GFP et l'histone RFP, imagé avec un objectif de 100 x sur un microscope confocal à disque tournant.

Le temps total indiqué est de huit minutes. Les courbes représentant la distance du pôle au pôle sont très reproductibles et constituent une mesure fiable du succès chez les embryons témoins. Elles doivent ressembler à celles présentées ici pour les cycles 11 à 13.

On observe dans ce film un autre embryon témoin. Celui-ci exprime KLP61F-GFP et a été injecté avec de la tubuline marquée au rhodamine. L'observation a également été réalisée avec un objectif 100 x sur un microscope confocal à disque tournant, et la durée totale est de sept minutes.

Ce film a été enregistré immédiatement après la microinjection, et le gradient de concentration de la tubuline r Domine est clairement visible au début du film. Ces embryons peuvent être utilisés pour étudier l'inhibition de Klp 61 F après microinjection de l'anticorps anti-Klp 61 F. On peut observer la perte de Klp 61 FGFP à partir des fuseaux.

Nous venons de vous montrer comment réaliser une microinjection chez les embryons de drosophile en stade de blastodermes cellulaires. Lors de cette procédure, il est important de prévoir des contrôles, de s'exercer d'abord à injecter du tampon ou de la rutine seul, et de s'assurer que la mitose progresse normalement au cours de la phase cellulaire. Une fois que toutes vos injections sont fiables et ne causent aucun dommage, vous pouvez injecter un inhibiteur et étudier l'effet de cette inhibition particulière.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.