Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

Bonjour, je suis Hillary Kemp du laboratoire de Cecilia Owens. Et je suis Cecilia Owens. Hillary et moi travaillons au sein de la division des sciences fondamentales du Fred Hutchinson Cancer Research Center à Seattle.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une technique permettant de produire des embryons de poisson zèbre chimériques, également appelés mosaïques génétiques. Cette procédure nous permet d'évaluer la base cellulaire de la fonction des gènes au cours du développement. Nous pouvons déterminer si un gène donné exerce sa fonction au sein des cellules présentant un phénotype mutant, ce qu'on appelle une fonction autonome pour la cellule, ou bien dans l'environnement de ces cellules, ce qu'on appelle une fonction non autonome pour la cellule.

Nous réalisons ces mosaïques en transplantant des cellules entre des embryons de type sauvage et des embryons mutants, soit au stade de blastula, soit au stade gastrulaire précoce. Nous évaluons ensuite la fonction des gènes en observant le phénotype et le génotype des cellules issues du donneur dans leur environnement hôte. Commençons donc.

Dans cette partie du protocole, un colorant de lignée est injecté dans l'embryon donneur afin de suivre le destin des cellules issues du donneur après transplantation. Toute variété d'acides nucléiques peut également être injectée à l'aide de cette technique ; toutefois, omettez l'étape de marquage lorsque vous injectez de l'ADN. Avant de manipuler les embryons, préparez un plat d'injection en insérant une lame de verre à un angle de 45 degrés traversant la partie la plus large d'une boîte de Pétri. Remplissez-la aux trois quarts avec du milieu pour embryons contenant 1,2 % d'aros dans du pen strep.

Retirez la lame après que l'agarose ait durci afin de former une rigole biseautée. Remplissez la rigole avec du milieu embryonnaire pénicilline-streptomycine. Poursuivez ensuite avec la décoration enzymatique des embryons au stade une cellule.

Incuber les embryons au stade une cellule pendant une à cinq minutes dans une solution de pronase à 0,5 milligramme par millilitre. Surveiller attentivement la décortication.

Dès que le chorion commence à s'effondrer visiblement, immergez les embryons dans l'eau du système, et versez délicatement pour éliminer tout le chorion. Les embryons restent alors au fond, à l'intérieur de la courbure du bec. Il est très important que les embryons n'entrent pas en contact avec la surface de l'eau une fois de plus, car la majorité d'entre eux ont déjà perdu leur chorion. Quelques-uns tournent encore à l'extérieur sans s'être débarrassés de leur enveloppe.

Si quelque chose est encore dans son chorion, alors l'acte de pipeter de cette manière permettra de les en extraire et libérera les embryons afin qu'ils n'entrent jamais en contact avec la surface de l'eau. Il est important de manipuler les embryons recouverts à l'aide d'une pipette dont les bords ont été lissés par fusion à la flamme. Transférez délicatement les embryons fragiles dépourvus de chorion dans la rigole de la boîte d'injection à l'aide d'une pipette en verre à large orifice, dont les bords ont été lissés par fusion à la flamme.

Ensuite, nous chargeons un seul fichier dans cette rigole. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés avec un marqueur de lignée à l’aide d’une micropipette en verre étirée au chalumeau précisément calibrée et d’un dispositif d’injection sous pression. Nous allons utiliser une boîte remplie de milieu pour embryons afin de briser l’aiguille et une autre boîte remplie d’huile pour calibrer l’aiguille.

Il s'agit simplement d'une huile minérale de qualité laboratoire standard. Nous prenons une paire de pincettes de bijoutier aiguisées, puis, en regardant à travers les oculaires pour déterminer la taille appropriée, nous plaçons les pincettes de chaque côté de l'aiguille, avant de détacher délicatement le fragment, ce que je ne peux pas faire sans regarder, afin de déterminer le volume de colorant ou de ribonucléotide délivré. Avant de commencer.

Mesurez la taille du bolus dans une boîte contenant de l'huile minérale. L'aiguille doit être cassée de manière à ce qu'un bolus d'un nanolitre soit délivré par une ou deux impulsions de la micro-injecteur. Le volume du bolus peut être calculé à partir de son diamètre mesuré à l'aide d'un micromètre oculaire.

Injectez un nanolitre d'une solution de dextrane fluorescent à 1 à 3 % directement dans le vitellus d'embryons enrobés, entre le stade une cellule et le stade quatre cellules. Ce que je vais faire, c'est positionner l'embryon juste sous l'aiguille. Je vais piquer délicatement l'aiguille au centre du vitellus et appuyer sur la pédale au pied.

Une fois l'injection effectuée, il est important d'injecter dans les courants de vitellus afin que le colorant soit transporté dans les cellules. Cette injection suffira à suivre les cellules dans les embryons chimériques pendant plusieurs jours de développement. Idéalement, nous réalisons cette étape avant que les cellules n'atteignent le stade à quatre cellules. Élever les embryons injectés à faible densité dans une boîte de Pétri revêtue, remplie de milieu pour embryons frais contenant de la pénicilline et du streptomycine.

Remarquez que les embryons injectés ont tendance à présenter un taux de développement légèrement ralenti ; faites incuber les embryons à différentes températures, 25, 28 et 31 degrés Celsius, afin d'échelonner leur développement et de maximiser la fenêtre temporelle pendant laquelle les greffes peuvent être réalisées. L'appareil utilisé pour la greffe cellulaire chez la blastula de poisson zèbre comprend une seringue Hamilton commandée par un moteur, reliée par un robinet à trois voies à un réservoir d'huile minérale et à un support de micropipette via un tube souple. Éliminez toutes les bulles d'air du système, car elles compromettraient votre capacité à contrôler l'aspiration et la pression.

Utilisez un microscope stéréo doté d'optiques de haute qualité d'au moins un grossissement DX. Pour contrôler le positionnement du porte-pipette et de l'aiguille, nous recommandons un micromanipulateur manuel NARA shige. Assurez-vous qu'il est fixé au banc à l'aide d'une base magnétique afin d'éviter la transmission de vibrations vers la greffe.

Les aiguilles de transplantation sont fabriquées à partir de pipettes capillaires en verre qui sont étirées en une pointe douce sur un polarisateur d'électrode. Consultez le protocole JoVE du laboratoire de Miriam Goodman pour obtenir des détails sur l'étirage des pipettes sous un microscope stéréoscopique, puis cassez l'extrémité de l'aiguille étirée. Pour les transplantations au stade de blastula, le diamètre extérieur de l'aiguille doit mesurer environ 50 à 60 microns, ou 30 à 40 microns pour un transfert au stade gastrula.

Pour un transfert gastro-intestinal améliorant la pénétration, une barbe acérée doit être formée à l'extrémité de l'aiguille à l'aide d'un micro-fer à souder : lissez la pointe de l'aiguille en l'approchant du filament du micro-fer. Ensuite, tournez l'aiguille de manière à ce que le bord avant du biseau entre en contact avec le filament. Dès que le bord avant de l'aiguille touche le filament, éloignez-la rapidement afin de créer une barbe.

Pour éviter d'endommager les cellules, la barbe doit être droite et la pointe de l'aiguille ne doit pas être courbée. Une fois le dispositif et les aiguilles de transplantation prêts, vous pouvez préparer des embryons chimériques. Les greffes à la blastula permettent de transplanter des cellules entre embryons lorsque des informations précises sur la carte de destin cellulaire ne sont pas nécessaires. À l'exception des cellules germinales primitives, la plupart des cellules ne sont généralement pas encore engagées vers un destin particulier à ce stade.

La carte des destinées embryonnaires de la blastula est telle que nous pouvons distinguer les cellules qui vont donner l'ectoderme de celles qui vont donner le mésoderme. Les cellules mésodermiques et endodermiques se situent près de la marge de l'embryon au stade blastula, tandis que les progéniteurs dermiques, qui vont donner le système nerveux et le derme superficiel, se trouvent plus éloignés de la marge de l'embryon. Ainsi, lorsque nous transplantons des cellules dans des embryons au stade blastula, nous pouvons cibler ces cellules vers le mésoderme présomptif ou vers l'ectoderme présomptif.

Mais nous ne pouvons pas cibler les cellules vers une région particulière de l'ectoderme ou du mésoderme, car nous ne le savons pas. Au stade de blastula, lorsque le côté dorsal de l'embryon est déterminé, préparez à l'avance les boîtes d'injection en plaçant un moule en plastique comportant des rangées doubles de protrusions en forme de coin dans une boîte de Pétri à moitié remplie de 1,2 % d'aros fondu dans le milieu pour embryon. Une fois que l'aros est solidifié, retirez le gabarit, laissant des rangées de puits en forme de triangle, chacun étant juste assez grand pour contenir un embryon.

Remplissez le moule de transplantation avec du milieu pour embryons contenant de la pénicilline et du streptomycine, puis chargez individuellement des embryons au stade de blastula dans chaque puits à l’aide d’une pipette en verre à embout feuilleté. Transférez ensuite les embryons dans les puits de greffe, en les laissant initialement sur le côté. Disposez les embryons de manière à ce que les embryons donneurs soient placés dans une colonne et les embryons hôtes dans la colonne adjacente.

Placer la boîte sur la platine de sorte que, lorsque l'aiguille de transplantation pénètre dans un embryon, celle-ci pousse l'embryon contre la paroi arrière de sa cavité. À l'aide du micromanipulateur, abaisser l'aiguille de transplantation dans la boîte selon un angle assez prononcé. Idéalement, l'aiguille de transplantation doit pénétrer dans l'embryon selon un angle d'environ 45 degrés.

Une fois que la pointe de l'aiguille est située sous la surface du milieu embryonnaire, aspirez une petite quantité de ce milieu dans l'aiguille en tournant le micromètre qui commande la seringue Hamilton. Pour un contrôle le plus précis possible, l'interface entre l'huile minérale et le milieu embryonnaire doit rester dans la partie effilée et fine de l'aiguille, sans être trop proche de l'extrémité. Positionnez délicatement l'embryon donneur à l'aide de l'aiguille, puis retirez légèrement l'aiguille et pénétrez dans le cap blastulaire de l'embryon à la position souhaitée.

Un coup sec et rapide pénétrera l'embryon sans provoquer de roulis. Aspirez lentement et soigneusement les cellules donneuses dans l'aiguille afin d'éviter de cisailler les cellules. Évitez d'aspirer du vitellus dans l'aiguille une fois le nombre souhaité de cellules prélevé.

Inverser légèrement la pression pour arrêter l'aspiration et retirer l'aiguille afin de positionner l'embryon hôte. En déplaçant la boîte de transplantation, de petits ajustements de la position de l'embryon hôte peuvent être effectués en le tournant délicatement à l’aide de l’aiguille de transplantation, à condition de ne pas toucher le vitellus. Lors de l’expulsion des cellules donneuses dans l’embryon hôte, éviter d’aspirer du vitellus à l’intérieur de l’embryon, car cela endommagerait et tuerait les cellules donneuses. Les cellules provenant d’un seul embryon donneur peuvent être transplantées vers plusieurs hôtes après avoir effectué les transferts cellulaires.

Transférez les paires d'hôtes donneurs vers les puits revêtus d'une plaque de 24 puits afin de poursuivre le développement. La seule exception à la règle selon laquelle les cellules ne sont pas engagées vers des destinées particulières au stade de blastula concerne les cellules germinales primitives. Les cellules germinales primitives sont déterminées très tôt au cours du développement et sont engagées dans leur destin de cellules germinales primitives.

Dès un stade très précoce, les cellules germinales primitives se trouvent près de la marge d'un embryon de blastula et d'un stade gastrula. Ainsi, si l'objectif de l'expérience de transplantation est de transplanter des cellules germinales primitives, il est alors très important de savoir d'où proviennent les cellules dans l'embryon donneur, mais peu important de savoir où elles sont dirigées dans l'embryon hôte. La règle est donc que, pour les cellules somatiques, l'endroit où elles se rendent dans l'embryon hôte déterminera leur destin.

Dans le cas des cellules germinales primitives, il est important de savoir d'où elles proviennent dans l'embryon donneur, car leur destin est déjà déterminé. Si l'objectif est de transplanter des cellules germinales primitives, celles-ci doivent être prélevées au niveau de la marge de l'embryon donneur, où elles se situent juste près de la bordure de l'embryon, regroupées en quatre petits amas de trois ou quatre cellules chacun, à ce stade embryonnaire appelé stade en lame ou stade élevé de développement. Il faut les prélever avec une grande précaution afin de ne pas aspirer accidentellement le vitellus.

Très bien, c'est donc ce que j'ai fait ici, et maintenant je passe à un embryon hôte. Les cellules germinales primitives migreront naturellement vers la crête génitale de l'embryon dans lequel elles se trouvent. Il n'est donc pas nécessaire de transplanter ces cellules germinales primitives au niveau de la marge, elles s'y rendront d'elles-mêmes.

Je procède donc simplement au transplant en replaçant les cellules n'importe où dans l'embryon postérieur. La clé des transplantations de cellules germinales, qui est tout à fait l'opposée de tout autre type de greffe, réside dans l'origine des cellules donneuses. Le fait de transplanter des cellules dans un hôte au stade gastrula permet à l'expérimentateur de tirer parti de la carte des destins cellulaires du poisson zèbre qui apparaît lorsque le bouclier embryonnaire devient visible.

Il devient possible de distinguer différents types de tissus ainsi que les domaines à l'intérieur du système nerveux central en formation. Lors du transfert de cellules entre embryons au stade gastrula, certaines variations existent dans le protocole, mais la procédure générale est similaire à celle utilisée avec les blastulas pour monter les gastrulas. Appliquez d'abord une bande verticale de méthylcellulose dans l'empreinte d'une lame porteuse en verre à fond creux, puis inondez-la généreusement avec du milieu pour embryons contenant de la pénicilline et du streptomycine à l'aide d'une pipette à embout arrondi par fusion à la flamme.

Un donneur et trois hôtes au stade écran pour la lame de dépression. Sélectionnez des embryons donneurs légèrement plus jeunes que les hôtes. Un nouvel outil est nécessaire pour manipuler la colle gastrique : insérez les extrémités d'un court morceau de fil de pêche de deux livres dans l'extrémité d'un tube capillaire.

Ainsi, formez une petite boucle. Utilisez la boucle pour faire rouler délicatement les embryons donneurs et hôtes vers le haut de la bande de méthylcellulose et enfoncez-les dans la méthylcellulose jusqu’à ce qu’ils soient bien fixés. Placez-les en roulant de façon à ce que la région ciblée soit en position supérieure.

Étant donné que, lors de la greffe, l’aiguille pénètre tangentiellement dans l’embryon afin d’insérer les cellules donneuses sans endommager le massé vitellin, les greffes au stade gastro sont mieux réalisées au microscope composé à stade fixe. Utilisez les commandes du micromanipulateur pour amener l’extrémité de l’aiguille de greffe dans le plan de mise au point.

Positionnez le support de micropipette et l'aiguille selon un angle assez faible, de sorte que l'aiguille soit aussi proche que possible de l'horizontale, dans la limite autorisée par le bord de la dépression de la lame. Ensuite, percez l'embryon donneur. S'il est correctement monté, il ne roulera pas lorsque l'aiguille de transplantation pénétrera, à moins que l'embryon ne soit trop âgé pour permettre à l'aiguille de pénétrer facilement.

Pour éviter de percer le vitellus, l'aiguille doit pénétrer l'embryon dans un plan focal légèrement plus profond que celui du muscle EDL. Une fois percé, un grand nombre de cellules peut être prélevé sur le donneur pour jusqu'à trois injections dans des cellules hôtes. Lors du prélèvement des cellules, évitez d'aspirer le vitellus en déplaçant l'aiguille pendant la prise des cellules, si souhaité.

Des embryons supplémentaires peuvent être récoltés pour obtenir davantage de cellules en utilisant la même aiguille avant d'expulser les cellules dans l'hôte. Pendant l'éjection des cellules dans l'embryon hôte, expulsez les cellules tout en retirant l'aiguille à travers la zone ciblée, plutôt que de déposer les cellules en un seul amas. Cela augmentera la probabilité que les cellules donneuses contribuent au tissu souhaité. Une fois les transferts cellulaires terminés, placez toute la lame dans une boîte de Pétri et inondez-la soigneusement avec du milieu pour embryon contenant de la pénicilline et du streptomycine.

Au cours des heures suivantes, le méthylcellulose se dissoudra, libérant les embryons. Le nombre de cellules transférées dépend de l'objectif précis de l'expérience. Les cellules provenant d'un seul donneur peuvent être transplantées dans trois ou quatre hôtes le lendemain matin suivant la transplantation.

Les hôtes peuvent être examinés afin de déterminer si le ciblage des cellules donneuses a été couronné de succès. Une transplantation réussie de cellules germinales primitives à l'âge de la blastula donne lieu à des cellules marquées par fluorescence, positionnées de manière ventrale près de la jonction entre le ylk et l'extension du ylk. Nous venons donc de vous montrer comment réaliser des greffes aux stades de gastrula et de blastula.

Lorsque vous utilisez cette technique, il est important de choisir le bon type de méthode de transplantation en fonction du tissu cible que vous souhaitez atteindre avec vos cellules. Ainsi, la greffe au stade de blastula suffit à déterminer si les cellules se dirigent vers le mésoderme ou vers l'ectoderme. Vous pouvez également utiliser cette technique pour cibler les cellules germinales primitives.

Si vous souhaitez effectuer une cartographie plus précise, il est préférable d'utiliser une greffe à l'âge gastrique, où le côté dorsal a déjà été déterminé. Avec cette technique, vous pouvez cibler des cellules vers différentes parties du système nerveux, en particulier le prosencéphale, le mésencéphale, l'encéphale postérieur et la moelle épinière. Voilà tout.

Merci beaucoup d'avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.