Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Bonjour, je suis Bruce Draper de l'Université de Californie à Davis, département de biologie moléculaire et cellulaire, et voici Cecilia Moans de la Division des sciences fondamentales du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson à Seattle. Aujourd'hui, Cecilia et moi allons démontrer le protocole de cryoconservation du sperme de poisson zèbre, une adaptation du protocole original de Brian Harvey. Nous allons vous montrer qu'en travaillant par équipes de deux, il est possible de cryoconserver le sperme de 100 mâles individuels en moins de deux heures.

Bien qu'il existe une grande variété de fertilité après décongélation, en moyenne, nous obtenons une fertilité de 25 %, et cela provient d'une banque cryopréservée depuis plus de sept ans. Commençons donc. Avant d'effectuer cette procédure, préparez tout d'abord les solutions de congélation des spermatozoïdes.

La solution de Ringer pour poisson Ginsburg est préparée fraîche tous les trois jours, et le milieu de congélation est préparé quotidiennement, avec ou sans méthanol. La composition de ces solutions est disponible dans les informations supplémentaires en ligne accompagnant ce protocole. Les matériaux utilisés dans cette procédure peuvent influencer la vitesse de congélation et de décongélation, ce qui peut à son tour affecter la fertilité du sperme congelé.

Pour cette raison, une liste de matériel recommandé est également fournie en tant qu'information complémentaire en ligne. Il est préférable de congeler le sperme sur de la glace sèche finement broyée plutôt que sur des pastilles de glace sèche. Une méthode simple pour broyer la glace sèche consiste à l'envelopper dans une serviette et à la pulvériser à l'aide d'un marteau.

Une méthode plus efficace consiste à utiliser un broyeur à glace sèche, tel qu'un modèle RE à griffes, pour congeler le sperme de poisson zèbre. Commencez par marquer des tubes capillaires de 10 microlitres avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 microlitres, soit environ 16,7 millimètres à partir du fond. Pour anesthésier les mâles, placez deux à quatre mâles dans un bécher contenant une solution de trica diluée dans de l'eau pour poissons. La recette peut être trouvée dans le livre sur le poisson zèbre.

Une fois anesthésiés, sortez les poissons de l'anesthésique à l'aide d'une cuillère en plastique et séchez-les délicatement avec une serviette en papier. Veillez particulièrement à bien sécher la face ventrale. L'eau active les spermatozoïdes, il est donc essentiel de bien assécher la zone autour de l'ika.

Placer le poisson sur le support en éponge, côté ventral vers le haut. Si la région autour des nageoires pelviennes est encore humide, la sécher délicatement avec un essuietout Kim. Placer le tube capillaire marqué dans un embout en caoutchouc pour pipette, fourni avec les tubes capillaires.

L'adaptateur est un tuyau en caoutchouc doté d'une embout buccal à une extrémité et d'un support de capillaire à l'autre. Alternativement, le tube capillaire peut être relié à une seringue Hamilton de 50 microlitres. À l'aide d'un court morceau de tube en tigon de diamètre approprié, placez l'individu mâle sous le microscope et exposez l'ouverture urogénitale en écartant délicatement les nageoires pelviennes.

À l’aide de l’extrémité du tube capillaire, exprimer le sperme en caressant doucement les flancs du poisson avec une pince lisse ou en comprimant délicatement les flancs du poisson entre l’index et le pouce, et recueillir le sperme dans un tube capillaire au fur et à mesure de son expulsion en appliquant une aspiration légère. Éviter les matières fécales qui pourraient être expulsées avec le sperme. Le volume cible de sperme est de 3,3 microlitres.

La quantité minimale de sperme acceptable varie selon la qualité du sperme. Un bon sperme est blanc et opaque, tandis qu’un sperme pauvre a une apparence aqueuse. En général, la quantité minimale acceptable de sperme est d’un microlitre de sperme de bonne qualité ou d’un tiers de la cible, et de deux microlitres de sperme pauvre ou des deux tiers de la cible.

Si le volume de sperme n'atteint pas le volume cible de 3,3 microlitres, il est nécessaire de normaliser le volume jusqu'au trait de repère à l'aide de milieu de congélation sans méthanol. Si le volume de sperme atteint déjà ou dépasse le trait de repère sur le tube capillaire, passez à l'étape suivante. Ajoutez maintenant le cryoprotecteur au sperme.

Aspirez le milieu de congélation avec du méthanol jusqu'au trait orange. Le volume total approximatif est maintenant de 20 microlitres. Expulsez délicatement le mélange de sperme et de cryoprotecteur sur une zone propre d'une lame de montre, puis mélangez en pipetant doucement de haut en bas environ quatre fois, en évitant d'introduire des bulles.

Prélevez une aliquote du sperme dans deux fioles de cryoconservation en pipettant 10 microlitres de la solution de cryoprotecteur pour sperme au fond de chaque fiole étiquetée. Fermez rapidement les fioles et déposez chaque fiole de cryoconservation dans un tube Falcon distinct de 15 millilitres. À température ambiante, fermez les tubes Falcon et insérez-les dans de la glace sèche finement pulvérisée.

Les tubes doivent être insérés suffisamment profondément pour que seuls les bouchons soient visibles, afin de repérer facilement les tubes Falcon. Numérotez-les et notez l'heure à laquelle chaque tube est placé dans la glace sèche. Laissez les spermatozoïdes congeler dans la glace sèche pendant 20 minutes.

Une fois que le sperme est congelé, transférez les deux cryotubes dans un flacon Dewar contenant de l'azote liquide, pour une conservation temporaire. Placez la boîte de congélation dans un bain d'azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas.

Utilisez des pinces métalliques longues pour récupérer les flacons du flacon donneur et manipulez-les avec des gants cryogéniques. Alternativement, les flacons cryogéniques peuvent être transférés directement depuis la glace sèche vers le congélateur. Si la boîte de congélation est conservée immergée dans l'azote liquide dans un récipient en polystyrène pour une conservation à long terme, placez les flacons cryogéniques dans un congélateur cryogénique à azote liquide.

Pour maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est essentiel que les flacons soient stockés immergés dans l'azote liquide ; les flacons stockés dans la phase vapeur peuvent perdre leur viabilité au fil du temps. La rapidité est également cruciale pour préserver la viabilité des spermatozoïdes. Le délai entre l'ajout du cryoprotecteur et la mise des flacons de spermatozoïdes sur de la glace sèche ne doit pas dépasser 30 secondes Fécondation in vitro.

L'utilisation de sperme cryoconservé donne les meilleurs résultats avec deux personnes. Une personne extrait les œufs des femelles tandis que l'autre décongèle le sperme. Régler un bain-marie à 33 degrés Celsius.

Retirer un cryotube de l'azote liquide et le transférer vers un flacon D ou un flacon contenant de l'azote liquide jusqu'à ce qu'il soit prêt à être décongelé. Extraire les œufs des femelles anesthésiées dans une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres. Cette procédure est décrite en détail dans le protocole JoVE intitulé « Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure », qui fournit une description approfondie du poisson-zèbre.

Pour la fécondation in vitro, une bonne ponte contient plus de 150 œufs uniformes et jaunâtres. Tout débris blanc indique une dégradation. Si possible, essayez d'obtenir trois pontes d'œufs et de les combiner dans un seul plat.

Si trois bonnes pontes ne sont pas obtenues dans l'minute suivant la première ponte, passez à l'étape suivante. Gardez la boîte couverte pendant que le sperme dégèle. Pendant ce temps, retirez le flacon de l'azote liquide et enlevez le bouchon.

Immergez rapidement le tube à essai à moitié dans un bain d'eau à 33 degrés pendant huit à dix secondes. Ajoutez rapidement 70 microlitres de solution saline tamponnée de Hank à température ambiante au tube à essai et mélangez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis ajoutez immédiatement aux œufs dans la boîte de Pétri et mélangez délicatement avec la pointe de la pipette. Ensuite, activez immédiatement les spermatozoïdes et les œufs en ajoutant 750 microlitres d'eau pour poisson, tourbillonnez pour mélanger et incubez pendant cinq minutes à température ambiante.

Après cinq minutes, remplir la boîte avec les poissons, de l'eau, et incuber à 28 degrés Celsius. Après deux à trois heures, compter et transférer les embryons viables dans des boîtes de 100 millimètres, avec 50 embryons par boîte. Compter également les œufs fécondés afin de déterminer la fécondité de l'échantillon de sperme.

La fertilité des spermatozoïdes correspond au rapport entre le nombre d'embryons viables et le nombre total d'ovules utilisés pour la fécondation in vitro. Les ovules peuvent être triés entre deux et six heures après la fécondation in vitro. Lorsque les ovules non fécondés sont facilement distinguables des embryons viables, ces derniers apparaissent clairs et non divisés.

Lorsqu'on les observe en transillumination au microscope stéréo, la fertilité moyenne des spermatozoïdes cryoconservés varie fortement. Toutefois, il devrait être possible d'obtenir une fertilité moyenne de 25 %, stable sur plusieurs années. Ce graphique montre le pourcentage moyen de fertilité des spermatozoïdes congelés entre 2001 et 2003 et testés aussi récemment qu'en 2008.

Nous venons de démontrer une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zéro. Lors de la réalisation de ce protocole, il est important d'utiliser tous les équipements et plastiques recommandés, ainsi que de la glace sèche broyée pulvérisée plutôt que des pastilles de glace sèche. Il est essentiel d'utiliser un sperme et des œufs de très haute qualité, et dans le cas des œufs, lors de la fécondation in vitro, immédiatement après avoir activé le sperme, il est important d'utiliser un nombre aussi élevé que possible d'œufs afin d'augmenter le nombre d'embryons fécondés obtenus à la fin, ce qui pourrait nécessiter trois à quatre femelles, n'est-ce pas ?

Un autre élément clé du protocole est la rapidité. Il ne devrait jamais s'écouler plus d'une minute entre l'expression du sperme du mâle et son dépôt sur de la glace sèche. Eh bien, je crois que c'est tout.

Bonne chance avec vos expériences.