Visualiser le cœur battant Drosophile

Deux techniques seront présentées ici pour la visualisation d'un cœur battant chez Drosophila afin de disséquer le cœur de l'adulte. Premièrement, la tête et le thorax sont retirés par une seule incision le long de la ligne indiquée. Ensuite, les organes génitaux sont enlevés et la cavité abdominale est ouverte à l’aide de pinces ; on retire l’intestin, et dans le cas d’une femelle, les ovaires.

Le corps adipeux abdominal des segments abdominaux trois et quatre est soigneusement aspiré afin d'exposer le cœur adulte pour l'immobilisation du cœur larvaire. Une larve unique placée dans une solution tampon est fixée en appliquant d'abord de la colle histologique acrylique autour de la région céphalique de la larve. La larve est délicatement étirée et de la colle supplémentaire est appliquée à l'extrémité postérieure, puis sur les flancs de la paroi corporelle de la larve.

Bonjour, je suis GI Fler. Bonjour, je suis Karen er. Nous faisons tous deux partie du programme Développement et Vieillissement à l'Institut Burnham pour la recherche médicale.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer les procédures que nous avons mises au point pour visualiser le cœur battant de drosophiles Laval et adultes. Nous utilisons ces deux préparations afin de visualiser, examiner et quantifier les paramètres des battements cardiaques chez la drosophile. Avant de commencer, nous préparons d'abord une solution artificielle d'hémolymphe.

Cette solution contient l'entrée de saccharose, helo, qui doit être ajoutée à l'hémolymphe artificiel à partir de solutions mères réfrigérées juste avant utilisation. Afin d'éviter toute contamination bactérienne, porter l'hémolymphe artificiel à température ambiante et oxygéner la solution par bullage d'air pendant au moins 15 minutes. Ensuite, tirer plusieurs capillaires fins à l'aide d'un tireur de pipettes standard, qui seront nécessaires pour le retrait des corps gras chez la drosophile.

Une fois que tout a été préparé, les mouches adultes doivent être anesthésiées. Cela peut être réalisé par une brève exposition à du fly nap pendant deux à cinq minutes, mais attention à ne pas laisser les mouches plus de cinq minutes dans le fly nap. Une exposition à court terme au froid peut également être utilisée pour anesthésier les mouches, mais le dioxyde de carbone n'est pas recommandé car il exerce des effets plus durables sur la fréquence cardiaque et l'ity.

Ensuite, les mouches anesthésiées sont placées en position dorsale vers le bas dans une boîte de Pétri recouverte d'une fine couche de vaseline. La cuticule hydrophobe des ailes et du corps doit adhérer de façon réversible à la vaseline, mais la mouche peut être repositionnée si nécessaire. Une incision initiale est effectuée à l'aide de ciseaux courbes à ressort.

Cela se fait en plaçant les lames des ciseaux sous les pattes de la drosophile et en les inclinant vers le bas, en direction de la surface dorsale près du cou. Le cordon nerveux ventral de la tête et les pattes sont retirés d’un seul coup de ciseaux. Le prélèvement est ensuite immergé dans une solution artificielle d’hémolymphe oxygénée à l’aide de ciseaux à ressort.

L'extrémité postérieure de l'abdomen, composée des segments abdominaux sept et huit, est retirée d'un seul coup de ciseau. Cela permet d'effectuer des incisions latérales le long des deux bords de l'abdomen et de sectionner la connexion entre l'intestin postérieur et la cuticule abdominale. Insérez les lames des ciseaux dans la petite ouverture située à l'extrémité de l'abdomen et découpez la cuticule latéralement.

Cela libère un bord de la cuticule ventrale. Saisir le lambeau avec une pince et effectuer une incision similaire le long du bord latéral opposé de l'abdomen. Le lambeau libéré de la cuticule abdominale ventrale peut désormais être retiré.

Les organes abdominaux, notamment l'intestin, peuvent généralement être retirés en un seul bloc à l'aide de pinces de bijoutier et en tirant doucement. L'ablation des organes internes met au jour le tube cardiaque en battement, qui reste attaché à la cuticule dorsale par de petits muscles artériels et est entouré de corps gras. Les capillaires extraits sont insérés dans un tube en plastique d'un seizième de pouce de diamètre, relié à une source de vide.

La force d'aspiration est proportionnelle au diamètre de la pointe, donc les pipettes dont les pointes ont un diamètre supérieur à 40 microns ne doivent pas être utilisées une fois le dispositif mis en place. Ce système d'aspiration permet de retirer l'excès de graisse autour du tube cardiaque. Il peut également servir à éliminer les bulles d'air qui s'accumulent autour de la cuticule ainsi que tous les débris.

Il faut faire preuve d'une extrême prudence pour éviter de toucher le cœur lui-même, et comme la partie postérieure du cœur est très fragile, cette région doit également être évitée. Le tube cardiaque de drosophile adulte est désormais exposé et devrait battre si nécessaire. La cuticule et le cœur qui y est attaché peuvent être repositionnés en soulevant délicatement la cuticule hors de la vaseline et en l'aplatissant soigneusement à nouveau.

Évitez tout contact avec le tissu cardiaque. À ce stade, la solution baignant le prélèvement doit être remplacée par de l'hémolymphe artificielle fraîche. Ce prélèvement doit être laissé équilibrer pendant 20 à 30 minutes avec oxygénation avant toute manipulation.

Si la préparation doit être maintenue pendant plus de 60 minutes, elle doit être repréfusée avec un hémolymphe artificiel frais. Cette préparation est désormais prête à être utilisée pour l’enregistrement optique et peut également servir pour l’enregistrement électrophysiologique ou pour des manipulations histologiques. Une technique différente est nécessaire pour visualiser le cœur battant à l’intérieur des larves.

Tout d'abord, préparez les lamelles la veille de la procédure. Pour ce faire, utilisez un cure-dent pour transférer environ 50 à 70 microlitres de solution Sard sur une lamelle de 22 sur 22 millimètres. Laissez le Sylgard durcir à 65 degrés Celsius toute la nuit.

Ensuite, préparez le tampon de Brody et Bates ; une fois préparé, des aliquotes peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius et décongelées au besoin. Enfin, préparez les outils nécessaires pour appliquer la colle histo acrale. Commencez par tirer plusieurs capillaires fins.

Ensuite, reliez une pipette de 1,5 millilitre à une petite tubulure en plastique d'environ un trente-deuxième de pouce de diamètre. En insérant l'extrémité la plus fine dans le tube, placez un capillaire dont l'ouverture large est dirigée vers l'autre extrémité. Une fois le montage effectué, chargez le capillaire avec de la colle histologique en plongeant l'extrémité du capillaire dans une goutte de colle et en exerçant une aspiration douce via l'embout en plastique.

Lorsque l'on travaille avec la colle, il est conseillé de disposer d'une deuxième micropipette en verre pour retirer l'excès de colle à l'extrémité de la micropipette de colle. La colle est liquide jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec la solution saline tamponnée, où elle durcit en quelques secondes. Toutefois, elle reste généralement malléable suffisamment longtemps pour être retirée de l'extrémité de la micropipette ou pendant son application sur l'échantillon.

Maintenant, pour commencer l'immobilisation des larves, déposez une goutte de colle histo acral près de chaque coin du syl guard. Ajoutez des lamelles et 50 microlitres de tampon B et B sur les gouttes de colle, qui durcissent instantanément ; remplissez l'espace entre les points collés avec du B et B. La colle maintiendra le tampon sur la lame.

Prenez trois larves au stade L3 errantes et placez-les sur un morceau de papier absorbant humide posé sur de la glace pendant deux minutes. Cela ralentira leurs mouvements. Ensuite, transférez les larves dans le tampon et positionnez-les avec la face dorsale vers le haut.

C'est le côté des larves qui ne possède pas les ceintures identiques. Appliquez rapidement un peu de colle entre la région de la tête et le pare-battant. La colle durcira très vite et empêchera la tête des larves de bouger.

À l'aide de pinces, saisissez délicatement l'animal par les reflets postérieurs et étirez-le doucement. Fixez les larves dans cette position en appliquant la colle sur les deux côtés des larves dans la moitié postérieure. Pour réduire davantage les mouvements de l'exosquelette provoqués par les muscles de la paroi corporelle, ajoutez plus de colle sur les flancs de l'animal.

La larve est désormais fixée dans cette position. La lame couvre peut être placée dans une petite boîte de Pétri remplie d'hémolymphe artificiel ou de PBS, et les battements cardiaques peuvent maintenant être enregistrés sans interférence des mouvements de la paroi corporelle. Le cœur de drosophile semi-intact battra de manière rythmique pendant plusieurs heures après la dissection, à condition d'être maintenu dans un hémolymphe artificiel frais et oxygéné.

Un exemple représentatif est montré ici ainsi que dans le film supplémentaire un, cœurs de larves de troisième stade en étoile présentés ici, et mouches jeunes, âgées d'une à trois semaines après l'éclosion, qui présentent généralement un rythme cardiaque régulier à des fréquences comprises entre un et trois hertz. Les mouches âgées de plus de trois semaines sont généralement plus arythmiques. Néanmoins, ces cœurs sont encore capables de battre spontanément pendant des heures dans un hémolymphe artificiel oxygéné. Les cœurs et les mouches adultes endommagés en raison de la procédure de dissection présentent typiquement des régions localisées de constriction extrême, incapables de se relâcher et souvent incontrôlables. Des fréquences cardiaques inférieures à un hertz sont rarement observées chez les mouches âgées de moins de trois semaines.

Par conséquent, ces préparations sont considérées comme endommagées et sont écartées. Nous venons de démontrer comment préparer des cœurs de drosophiles adultes pour l'imagerie optique. N'oubliez pas, lors de la réalisation de la préparation semi-intacte, de ne jamais toucher directement le cœur.

Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.