Visualisation de la réplication d'ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

Dans cette technique, des lamelles en verre sont fonctionnalisées avec un mélange de molécules de PEG inertes et de PEG biotine. Une cellule d'écoulement est créée à l'aide de cette surface fonctionnalisée et placée sur un microscope à épifluorescence. Des matrices de roulage biotinylées sont fixées à la surface à l'aide de streptavidine multivalente.

Lorsque les substrats sont répliqués par l'ajout de protéines de la zone de réplication et de nucléotides, l'ADN double brin résultant est allongé par écoulement laminaire et observé en temps réel à l'aide d'un colorant intercalant. Bonjour, je suis Nathan Tanner du laboratoire d'Antoine Van Ian, du Département de biochimie biologique et de pharmacologie moléculaire à la faculté de médecine de Harvard. Je suis Joe Laro, également du laboratoire Van Noian.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie par fluorescence de la réplication de l'ADN en temps réel au niveau de la molécule unique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les activités coordonnées de synthèse de l'ADN par des complexes de réplication individuels. Commençons donc.

Pour commencer cette procédure, annelez l'oligo portant une queue biotinylée à l'ADN simple brin M13 en ajoutant un excès dix fois supérieur d'oligo dans un tampon TBS, en chauffant à 65 degrés Celsius, puis en éteignant le bloc chauffant pour permettre un refroidissement lent afin d'assurer un bon appariement du primer. Maintenant que le primer M13 est prêt, ajoutez-le à un mélange contenant 64 nanomolaire de polymérase ADN T7 et du tampon de réplication T7 contenant des dNDP et du chlorure de magnésium, puis incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes. À la fin de l'incubation, arrêtez la réaction avec du EDTA à 100 millimolaire.

Ensuite, purifiez l'ADN du produit comblé à l'aide d'un mélange phénol-isoamyl alcool-chloroforme, extrayez et dialysez dans un tampon TE ou un autre tampon de stockage approprié. Effectuez une extraction inverse de chaque phase organique afin de récupérer tous les amorces résiduelles. Après dialyse, déterminez la concentration en ADN à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible. Une seule itération de préparation du modèle permet d'obtenir une concentration nanomolaire suffisante de matrice pour des centaines à des milliers d'expériences au niveau de la molécule unique.

Maintenant que l'ADN est prêt, passez à la préparation des lamelles fonctionnalisées. L'ADN à répliquer est fixé sur des lamelles en verre fonctionnalisées avec Amil Lane, le groupe Oxy de l'Amil se liant au verre et laissant un groupe amin disponible pour fixer des molécules de PEG biotinylées. Ce revêtement permet de réduire la liaison non spécifique à la surface.

Pour nettoyer soigneusement les lamelles en verre, placez-les dans des bocaux de coloration et remplissez les bocaux d'éthanol soumis à une sonication. Rincez les bocaux pendant 30 minutes, puis remplissez-les avec une solution d'hydroxyde de potassium à un molaire et soumettez-les à une sonication pendant 30 minutes ; répétez ces deux lavages. Pour la première réaction de fonctionnalisation, toutes les traces d'eau doivent être éliminées.

Remplir les bocaux de coloration avec de l'acétone et placer au bain à ultrasons pendant 10 minutes. Vider les bocaux et les remplir à nouveau avec de l'acétone. Passer ensuite à l'ajout du réactif sine dans les bocaux et agiter pendant deux minutes.

Ensuite, arrêter la réaction en ajoutant un large excès d'eau. Puis sécher les lamelles en les faisant cuire à 110 degrés Celsius dans une étuve pendant 30 minutes. Préparer ensuite le mélange de PEG à environ 0,2 % en poids par volume à l'aide de PEG aminé, l'ajout d'un espaceur en lamelle de verre permettant de séparer les lamelles ; pipeter 100 microlitres sur une lamelle silylée sèche.

Placer une deuxième lame à couvrir par-dessus. Incuber les lames à couvrir dans la solution de PEG pendant trois heures. Ensuite, séparer chaque paire de lames à couvrir et laver abondamment à l'eau.

Veillez à maintenir les lames à couvrir avec leur face fonctionnalisée vers le haut, car un seul côté sera recouvert de PEG. Enfin, séchez les lames à couvrir à l'air comprimé et stockez-les sous vide dans un dessiccateur ; les surfaces restent stables pendant au moins un mois. Ainsi, des dizaines de lames à couvrir peuvent être préparées par lot et utilisées au besoin.

À présent que les lamelles sont prêtes, on peut assembler la chambre d'écoulement pour l'expérience de molécule unique. Commencez par placer 20 à 25 millilitres de tampon de blocage contenant de l'albumine de sérum bovin (BSA) dans un dessiccateur afin d'éliminer toute bulle d'air pour les étapes ultérieures. Ensuite, diluez 25 microlitres de streptavidine dans 100 microlitres de PBS et répartissez la solution sur la surface d'une lamelle fonctionnalisée avec des ergots ; incubez pendant 20 minutes à température ambiante pour permettre à la streptavidine de se lier à la biotine de surface, tout en préparant les autres parties de la chambre.

Pendant l'incubation du coverslip, découper un morceau de ruban adhésif double face, avec protection sur les deux côtés, de manière à ce qu'il corresponde à la taille de la lame de quartz utilisée pour assembler la chambre d'écoulement. Marquer à l'aide d'un crayon la position des trous pour les tubulures sur le ruban afin de pouvoir tracer le contour de la chambre d'écoulement sur celui-ci. Après avoir marqué les trous, dessiner un rectangle d'une largeur de deux millimètres autour des marquages.

Ce rectangle servira de canal d'écoulement ; veillez donc à réaliser des côtés droits et à laisser suffisamment d'espace autour de l'entrée et de la sortie du tube. Découpez maintenant le ruban marqué le long du contour tracé, en effectuant des coupes droites et nettes afin de garantir qu'aucun adhésif ne dépasse dans le canal. Nettoyez soigneusement la lame de quartz à l'aide d'acétone pour éliminer tout adhésif résiduel provenant de la construction de la cellule d'écoulement utilisée lors d'expériences précédentes.

Trouvez l'alignement optimal du contour du canal. Retirez un côté du support adhésif et placez soigneusement le ruban sur la lame porteuse. Veillez à bien aligner le ruban afin que les orifices d'entrée et de sortie restent dégagés.

Ensuite, préparez les morceaux de tube de 0,76 millimètre de diamètre pour l'entrée et la sortie de la cellule d'écoulement. Il est utile de couper l'extrémité du tube selon un angle d'environ 30 degrés afin que le tube ne s'aplatisse pas contre le fond de la chambre. Placez les tubes sur des porte-tubes pour faciliter leur raccordement à la cellule d'écoulement lors des étapes suivantes.

À présent, l'incubation du lamelle est terminée. Rincez soigneusement la lamelle revêtue de streptavidine ENC à l'eau et séchez-la à l'aide d'air comprimé. Veillez à ne pas retourner la lamelle, car un seul côté est fonctionnalisé.

Enfin, terminez le montage de la chambre d'écoulement en retirant l'autre côté du support adhésif et en plaçant la lame de quartz sur le couvre-objet. Appuyez légèrement sur le couvre-objet pour chasser tout air piégé dans l'adhésif. Cela aidera à prévenir l'entrée de bulles d'air dans le canal d'écoulement.

Scellez les côtés de la chambre avec de l'époxy. Insérez le tube coupé dans les trous du quartz et fixez-le avec de l'époxy, puis laissez sécher quelques minutes. Une fois le joint d'époxy sec, commencez le blocage de la surface.

À l’aide d’une aiguille de 21 gauge, aspirez un peu de tampon de blocage Degas à travers l’un des tubes. Rincez plusieurs fois pour éliminer les bulles d’air et laissez la chambre incuber pendant au moins une demi-heure avant de passer à l’expérience de réplication unique de molécule.

Maintenant que la cellule d'écoulement a été bloquée, placez-la sur la platine du microscope. Maintenez la chambre en place à l'aide de pinces de platine et assurez-vous que le canal d'écoulement est aligné selon l'axe y. Connectez le tube de sortie de la cellule d'écoulement à la pompe à seringue à l'aide d'un tube de raccordement de diamètre plus grand.

Placer l'entrée dans du tampon de blocage et tirer doucement sur la seringue pour éliminer tout air présent dans le tube. Un léger tapotement sur le tube de sortie aidera à éliminer les bulles d'air piégées dans la cellule d'écoulement. Ajouter ensuite l'ADN, diluer le modèle d'ADN stock à 25 picomolaire dans un millilitre de tampon de blocage et faire circuler la solution dans la chambre à un débit modéré, par exemple 0,025 millilitre par minute, pendant 30 minutes afin d'obtenir une bonne couverture de la surface par l'ADN.

Une fois l'ADN introduit dans la chambre, éliminer l'excès d'ADN en effectuant un lavage avec le tampon de blocage pendant au moins 200 volumes de la cellule d'écoulement. Pour éliminer tout l'ADN libre, allumer le laser et la caméra. Le CCD refroidi doit atteindre sa température avant de pouvoir être utilisé.

Après avoir éliminé l'excès d'ADN et dégazé le tampon de réplication, préparez le mélange de réaction de réplication contenant les nucléotides, le DTT et la cytoxine dans le tampon de réplication. Ajoutez ensuite les protéines et mélangez délicatement. Ensuite, introduisez le mélange réactionnel dans la chambre d'écoulement.

La vitesse d'écoulement doit être suffisante pour étirer l'ADN double brin dans un canal d'écoulement de deux millimètres de largeur et de 100 micromètres de hauteur ; un débit de 0,04 millilitre par minute convient bien. Laisser suffisamment de temps pour que le mélange pénètre dans la chambre, environ 10 minutes.

Déplacez le champ de vision vers le côté du canal et focalisez-vous sur le matériau adhésif afin de vous assurer que vous êtes proche de la surface pour la mise au point et le début de l’imagerie. Ajustez la puissance du laser, la mise au point du microscope et l’angle du peigne. Maintenez la puissance faible pour éviter toute clivaison photo-induite de l’ADN marqué.

Acquérez des images à raison d'une à cinq images par seconde pendant plusieurs minutes, selon la vitesse de réplication de l'ADN. Répétez l'opération pour obtenir des trajectoires de réplication plus longues ou déplacez-vous vers un nouveau champ pour observer davantage de molécules lorsque presque tout le mélange réactionnel a été introduit dans la cellule ; faites circuler davantage de tampon avec du cyt pour examiner d'autres champs de vision. La prise d'images multiples de différentes molécules répliquées permet d'obtenir des statistiques pour la détermination de la productivité.

Dans le cercle roulant. L'essai de réplication par allongement de brin direct étend la queue reliant le cercle à la surface, et cette queue est convertie en ADN double brin par la polymérase du brin discontinu, puis étirée par un écoulement laminaire, comme illustré. Voici un exemple de champ de vision avec du cyt orange en excitation à 532 nanomètres.

Les petits points fluorescents sont des substrats non répliqués attachés. Remarquez la longueur extrême des produits et le grand nombre de produits par champ. Un champ typique montre de nombreuses molécules en cours de réplication, visibles sous forme de lignes brillantes allongées d'ADN coloré. Les expériences sur E Coli à 37 degrés Celsius donnent de cinq à cinquante molécules par champ, selon la densité de surface.

La zone de réplication T7 démarre de manière beaucoup plus efficace et répliquera plus de 50 % des molécules dans un champ. Avec une telle densité élevée, il est difficile de distinguer les molécules individuelles, comme on le voit ici. Réalisez donc l'expérience avec le système T7 à des concentrations protéiques ou à une densité de surface plus faible. Les graphiques Chime de molécules répliquant typiques provenant des expériences avec E. coli et T7 incluent les trajectoires finales de molécules d’E. coli et de T7 tracées en fonction du temps. Ces trajectoires sont ajustées par régression linéaire afin d'obtenir les taux de réplication, qui sont dans cet exemple de 467,1 paires de bases par seconde pour E. coli et de 99,4 paires de bases par seconde pour T7.

Pour T7, les distributions de vitesse des trajectoires de molécules uniques, ajustées par des gaussiennes simples, donnent une moyenne de 535,5 ± 39 paires de bases par seconde pour E. coli et de 75,9 ± 4,8 paires de bases par seconde pour T7. Pour T7, les distributions de longueur des produits de réplication sont ajustées par une décroissance exponentielle simple afin d'obtenir le rendement, qui est de 85,3 ± 6,1 kilo paires de bases pour E. coli et de 25,3 ± 1,7 kilo paires de bases pour G7. Nous venons de vous montrer comment mesurer la réplication coordonnée de l'ADN au niveau de molécules uniques.

Lors de cette procédure, il est important de bien fonctionnaliser les lamelles et de réaliser des canaux d'écoulement propres et rectilignes. Veillez à contrôler la puissance du laser et à minimiser le clivage photochimique de l'ADN long. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.