Assemblée, de chargement, et l'alignement d'une cellule échantillon ultracentrifugation analytique
5 novembre 2009
L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.
Bonjour, je suis Andrea Balbo. Je travaille au sein du groupe de Peter Schuck aux Instituts nationaux de la santé. Dans cette vidéo, nous allons vous démontrer nos procédures d'assemblage, de chargement et d'alignement du rotor d'une cellule d'échantillon pour ultracentrifugeuse analytique.
Commençons. Voici les composants d'une cellule d'échantillon pour ultracentrifugeuse analytique. À l'intérieur du boîtier de cellule, on trouve un centre en époxy de 12 millimètres à double secteur avec champ en charbon actif, qui sera placé entre deux ensembles de fenêtres. Chaque ensemble de fenêtre se compose d'un joint d'étanchéité, d'un insert de fenêtre et d'une fenêtre maintenue à l'intérieur du support de fenêtre.
Ces pièces seront ensuite insérées à l’intérieur du logement de la cellule en alignant leurs rainures avec la clé située à l’intérieur du barillet du logement, suivies d’un joint de logement, puis d’un anneau vissé qui fermera la cellule d’échantillon avec une pression de couple comprise entre 120 et 140 pouces-livres. Après avoir chargé votre échantillon, deux joints bouchons de logement et un bouchon de logement obturent les orifices de chargement de la cellule afin d’éviter les artefacts de balayage, les fuites et les ruptures pendant les expériences. Il est essentiel que tous les composants soient propres, secs, exempts de poussière, en parfait état, régulièrement inspectés et remplacés si nécessaire. Vous aurez également besoin du matériel suivant : un ultracentrifugeuse analytique, un rotor en titane à quatre trous, une balance de laboratoire, une clé dynamométrique munie d’un cadran lisible et d’un support de couple, un contrepoids et des masses de contrepoids, un tournevis plat, une paire de forceps, une pipette de 200 microlitres équipée d’une pointe de pipette longue et effilée, des outils d’alignement et un lubrifiant pour revêtement par rotation.
Nous commençons la construction de l'échantillon en assemblant deux ensembles de fenêtres. Placez d'abord un joint de fenêtre au fond du support de fenêtre. Ensuite, positionnez le revêtement de fenêtre, parfois appelé coussinet de fenêtre, à l'intérieur du support de fenêtre de sorte que l'ouverture du revêtement soit opposée à la rainure du support, selon un léger angle.
Ensuite, placer la fenêtre dans le support en alignant la marque de repère sur la fenêtre avec la rainure du support de fenêtre. Appuyer doucement sur les bords extrêmes des deux côtés de la fenêtre. Pour assurer un bon étanchéité et un positionnement précis de la cellule d'échantillon, nous appliquons légèrement un enduit sur le joint d'étanchéité logé dans l'anneau vissable.
Avec le lubrifiant pour revêtement par rotation, appliquez une très petite quantité de ce revêtement entre votre pouce et votre index. Enduisez les filets de l'anneau vissable d'un film fin, invisible, de revêtement par rotation. Enduisez de la même manière le joint du boîtier.
Essuyez tout lubrifiant visible. Pour commencer l'assemblage de la cellule d'échantillon, faites glisser un ensemble de fenêtre, la fenêtre orientée vers le haut face à vous, dans le boîtier de la cellule en alignant la rainure avec la clavette du boîtier.
Alignez la clavette du composant central avec la clé du boîtier et laissez-la tomber délicatement sur l'ensemble de la fenêtre située à l'intérieur du boîtier. N'utilisez jamais d'outil pour enfoncer le composant central dans le boîtier de la cellule. Cela pourrait endommager définitivement le composant central, entraînant des fuites lors des expériences de stockage.
Positionnez le deuxième ensemble de fenêtre de manière à ce que la fenêtre soit orientée vers l'élément central et tournée vers l'extérieur, loin de vous. Alignez la rainure avec la clavette du boîtier et faites-la glisser vers le bas par-dessus l'élément central. Placez le joint du boîtier par-dessus.
Ensuite, un anneau à visser de manière à ce que le mot « out » soit visible. À l’aide de vos doigts, puis un outil d’alignement, vissez fermement l’anneau à la main.
Parfois, l'élément central ne glisse pas facilement dans le barillet du boîtier. Vous pouvez d'abord l'aligner, puis placer le deuxième ensemble de fenêtre par-dessus. En exerçant une pression douce vers le bas sur l'ensemble de la fenêtre.
Vous pouvez insérer les deux simultanément dans le logement de la cellule. De cette manière, nous évitons d'appuyer directement sur la pièce centrale. Il est maintenant opportun d'examiner la cellule à la recherche de poussière, de peluches et d'empreintes digitales.
Vous remarquerez également les anneaux de Newton, qui indiquent qu'il reste de l'air entre la pièce centrale et les fenêtres. Ceux-ci disparaîtront après le serrage avec la bague vissée et le mot sortant visible. Insérez complètement la cellule d'échantillon à l'intérieur de la cellule.
Couple de serrage du mandrin du support de couple. Maintenir la cellule en place en appliquant une pression constante sur la poignée du support de couple. D'un seul mouvement continu, serrer l'anneau à vis au couple compris entre 120 et 140 livres-pouces.
Relâchez la poignée du support de couple et retirez soigneusement la cellule d'échantillon. Nous chargeons habituellement un volume de 400 microlitres dans chaque secteur du plateau central de 12 millimètres. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, positionnez la cellule d’échantillon avec les orifices de chargement vers le haut et le mot « out » sur l’anneau vissable bien visible.
Faites glisser la pointe de la pipette à mi-hauteur dans le secteur central gauche à travers les orifices de chargement et délivrez lentement 200 microlitres de solution de référence. Répétez une fois afin d'obtenir un volume total de 400 microlitres, en utilisant la même pointe de pipette et la même technique, avec précaution et lentement. Remplissez le secteur central droit avec 400 microlitres de solution échantillon.
Il est impératif d'ajuster au plus près les volumes des solutions de référence et d'échantillon. Bien fixer l'embout de la pipette sur la pipette, charger et distribuer lentement les solutions, éviter la formation de bulles lors du chargement, et utiliser le même embout pour les deux solutions permettent tous de maintenir des volumes égaux afin d'obturer la cellule.
Insérez fermement deux joints de bouchon de logement rouges dans chaque orifice de chargement, en veillant à les positionner soigneusement entre l'élément central et le logement en aluminium. Couvrez chaque orifice de chargement avec un bouchon de logement et serrez à la main à l’aide d’un petit tournevis plat. Avant de charger le rotor, assurez-vous que le contrepoids et la cellule qui lui sera opposée ont un écart de masse inférieur à 0,5 gramme.
Commencez par régler la balance à zéro. Pesez d'abord une cellule d'échantillon qui sera placée en position opposée au contrepoids. Remettez la balance à zéro pour soustraire le poids de la cellule d'échantillon.
Ensuite, peser le contrepoids. Ici, nous constatons que le contrepoids est 4,193 grammes plus léger que la cellule d'échantillon. Sélectionner un contrepoids de quatre grammes et le visser dans le trou de fixation du contrepoids, en veillant à ce qu'il ne dépasse pas par le haut.
Équilibrez le contrepoids afin que le poids final soit compris dans une marge de 0,5 gramme. À l’aide d’un rotor à quatre trous, placez le contrepoids en position quatre de sorte que la flèche blanche soit visible et orientée dans le sens de la force centrifuge. À l’aide d’un outil d’alignement, assurez-vous qu’il est complètement enfoncé à l’intérieur du rotor.
Positionnez la cellule d'échantillon de la balance avec les bouchons du boîtier tournés vers le centre du rotor et le mot « out » sur l'anneau à vis visible. Utilisez à nouveau un outil d'alignement pour vous assurer qu'elle est complètement enfoncée à l'intérieur du rotor, en regardant par en dessous le rotor.
Alignez l'intérieur. À l’aide d’un outil d’alignement, reportez la marque la plus proche du centre du rotor sur le contrepoids à l’aide d’un tracé. De la même manière, alignez la cellule d’échantillon à la position deux.
Une fois que toutes les cellules sont alignées, le rotor est prêt à être placé dans la chambre de la centrifugeuse.
Aperçu
Cette vidéo montre le montage, le chargement et l'alignement d'une cellule d'échantillon pour ultracentrifugeuse analytique (AUC), une étape cruciale pour les expériences d'AUC. Une manipulation et une préparation adéquates des composants de la cellule d'échantillon sont soulignées afin de garantir des résultats précis.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Ultracentrifugation analytique
- Méthodes biophysiques
- Techniques de préparation des échantillons
Contexte
- La cellule d'échantillon AUC est essentielle pour réaliser des expériences à des vitesses élevées du rotor.
- Elle se compose de plusieurs éléments qui doivent être assemblés avec précision.
- Il est crucial de maintenir la propreté et un alignement correct afin d'éviter les artefacts expérimentaux.
- Comprendre le processus d'assemblage est fondamental pour les chercheurs utilisant l'AUC.
Objectif de l'étude
- Fournir un guide détaillé sur le montage et le chargement d'une cellule d'ultracentrifugation analytique (AUC).
- Mettre en évidence l'importance d'une préparation méticuleuse dans les expériences d'ultracentrifugation analytique.
- Garantir que les chercheurs puissent reproduire le processus avec précision.
Méthodes utilisées
- Assemblage des éléments de fenêtre et du composant central dans la cellule d'échantillon.
- Application d'un couple pour fixer les composants de la cellule d'échantillon.
- Chargement des solutions de référence et d'échantillon dans la cellule.
- Équilibrage de la cellule d'échantillon à l'aide d'un contrepoids pour des mesures précises.
Résultats principaux
- Assemblage réussi de la cellule d'échantillon pour l'UCP, tel que démontré dans la vidéo.
- Les techniques de chargement appropriées garantissent un nombre minimal de bulles et des volumes égaux.
- Les réglages de contrebalancement sont essentiels pour une performance précise du rotor.
- Des indicateurs visuels, tels que les anneaux de Newton, aident à évaluer la qualité de l'assemblage.
Conclusions
- Une attention méticuleuse à l'assemblage des cellules d'échantillonnage est essentielle pour les expériences d'ultracentrifugation analytique (AUC).
- Le respect des procédures décrites peut améliorer la fiabilité expérimentale.
- Un entretien régulier et un contrôle des composants sont recommandés.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'assemblage et l'alignement corrects des cellules d'échantillon d'ultracentrifugeuse analytique sont essentiels pour obtenir des données biophysiques fiables sur la taille, la forme, la pureté et les états d'oligomérisation des protéines. Une préparation méticuleuse des cellules d'échantillon réduit au minimum les artefacts expérimentaux, garantissant l'intégrité des données pour la validation des cibles et les études mécanistiques en phase précoce de découverte de médicaments. Cette rigueur procédurale renforce la fiabilité prédictive des criblages ultérieurs et des optimisations de composés leaders.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la détermination précise des états d'oligomérisation des protéines et des interactions protéine-protéine, informant directement les hypothèses de validation de cibles.
- Valeur opérationnelle : Offre une évaluation sans marquage, en solution, des propriétés des macromolécules dans des conditions proches de l'état natif.
- Valeur prédictive : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la dé-risquisation des cibles en fournissant des coefficients de sédimentation quantitatifs et des paramètres de forme.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des données sur la taille et la forme hydrodynamiques, essentielles à la formulation des tampons d'essai et au criblage de la stabilité.
- Valeur opérationnelle : Garantit l'intégrité et la monodispersité des échantillons, critiques pour la reproductibilité des essais biochimiques et cellulaires.
- Intégration à la plateforme : Permet la caractérisation biophysique de cibles purifiées avant des campagnes de criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet l'évaluation de la formation de complexes protéiques et des changements conformationnels liés aux mécanismes des maladies.
- Valeur opérationnelle : Permet de vérifier la cohérence entre différents lots de protéines recombinantes utilisées dans les modèles précliniques.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la caractérisation biophysique de la cible et les tests fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le flux de travail relatif à la cellule d'échantillon d'ultracentrifugation analytique s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible jusqu'à l'identification du composé candidat, en fournissant des données biophysiques qui orientent les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en fonction du comportement et de la stabilité de la cible.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses concernant l'oligomérisation des cibles et leurs réseaux d'interaction, permettant une réduction des risques biologiques avant le développement de tests.
- Écrans : Garantit la monodispersion et la stabilité de la cible, influant directement sur la préparation aux tests et la qualité des données lors des campagnes de criblage.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives du coefficient de sédimentation et de la masse moléculaire, permettant de comparer les états protéiques dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la caractérisation biophysique de la cible purifiée à sa validation fonctionnelle dans des modèles précliniques, grâce à une qualité de matériel constante.
- Réutilisation institutionnelle : Constitue une capacité standardisée et réutilisable de caractérisation biophysique applicable à plusieurs cibles et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans les propriétés de la cible, réduction de l'ambiguïté mécanistique et amélioration de la rigueur de la validation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Préparation standardisée des échantillons, reproductibilité entre les essais et évolutivité entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Décisions « aller/ne pas aller » mieux éclairées, taux d'échec réduits dus à l'instabilité de la cible et efficacité améliorée du capital dans les phases précoces de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Hiérarchisation des cibles ajustée au risque, basée sur des données de dé-risque biophysique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques biophysiques et une manipulation précise des composants optiques.
- Dépend d'instruments d'ultracentrifugation analytique, de clés dynamométriques, d'outils d'alignement et d'une manipulation d'échantillons compatible avec les salles blanches.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de nettoyage, d'assemblage et d'application du couple de serrage.
- Implique des adaptations selon les types d'échantillons, les conditions de tampon et les géométries des cellules-centre.
- Limité par la fragilité des composants ; les fenêtres et les cellules-centre sont sensibles aux dommages causés par les particules, un couple de serrage inapproprié ou un mauvais alignement.
