Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Bonjour, je suis Hope Campbell, spécialiste en cytométrie en flux au Blood Research Institute du Blood Center of Wisconsin. Bonjour, je suis STR Baso, étudiant diplômé dans le laboratoire de la Dre Bonnie Dieter. Je travaille également au Blood Research Institute du Blood Center of Wisconsin.

Aujourd'hui, nous allons réaliser une procédure d'isolement de cellules par tri cellulaire activé par fluorescence. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la fonction des populations de lymphocytes et de cellules myéloïdes. Commençons.

Dans cette procédure, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 seront purifiés à partir de cytes de souris. Le nombre initial de cellules cibles doit être calculé en fonction du nombre de cellules nécessaires et du taux de récupération de l'appareil utilisé selon cette méthode. Le taux de récupération typique pour les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 est de 85 à 90 %. La population initiale de cytes SP comprend environ 60 à 70 % de lymphocytes B et 20 à 30 % de lymphocytes T.

Ainsi, si vous partez de 100 fois 10 puissance 6 cellules, vous serez en mesure de récupérer 50 à 60 millions de cellules B et 20 à 30 millions de cellules T avant le début des faits. Les solutions et réactifs nécessaires au protocole doivent être placés sur de la glace. Ces éléments comprennent un tampon de marquage constitué de sérum physiologique tamponné au phosphate contenant 3 % de sérum de veau fœtal, un tampon de suspension constitué de 25 millimolaire de HEPES préparé dans une solution saline équilibrée de Hank ou HBSS contenant 3 % de sérum de veau fœtal, une solution de HEPES B à 25 millimolaire préparée dans du sérum de veau fœtal, des anticorps de marquage et des billes de compensation.

Ce protocole nécessite également les fournitures et réactifs suivants. Des tubes coniques de 15 millilitres, des tubes d'écoulement en polystyrène ou en polypropylène de 12 par 75 millimètres. Un tamis à cellules en nylon, le bleu de trypan et un cytomètre hématologique, ainsi que des tubes de collecte pour tri, doivent également être préparés à l'avance pour réaliser cette manipulation.

Ajouter 300 microlitres de la solution FCS au he ou 1 millilitre de la solution HEPs FFC S à des tubes de flux ou à des tubes coniques de 15 millilitres. Ces tubes doivent être placés sur de la glace jusqu'au début du processus de collecte. Commencer par générer une suspension monocellulaire de la population cellulaire souhaitée.

Si les cellules isolées selon cette procédure doivent être cultivées, toute la préparation cellulaire doit être effectuée dans une hotte de culture tissulaire. À l’aide d’une technique stérile, laver les cellules une fois en ajoutant un tampon de marquage glacé et en resuspendant les cellules par retournement du tube plusieurs fois.

Ensuite, centrifuger les cellules pendant sept à huit minutes à environ 250 ×g et 4 °C. Les conditions de lavage peuvent varier selon le type et la concentration des cellules. Pour les cytes, laver jusqu'à 200 × 10⁶ cellules avec 10 millilitres de tampon de marquage.

Retirez soigneusement le surnageant par aspiration afin que le culot cellulaire reste intact. Resuspendez ensuite les cellules dans un tampon de marquage glacé à une concentration allant jusqu'à 50 fois 10 à la puissance six par 100 microlitres. Resuspendez le culot cellulaire en tapotant légèrement le tube ou en vortexant doucement.

Ensuite, transférez de 0,25 à une fois 10⁶ cellules dans un nouveau tube à flux en polystyrène ou en polypropylène de 12 par 75 millimètres sur de la glace. Mettez-le de côté pour l'utiliser ultérieurement comme échantillon témoin non coloré. Au premier tube, ajoutez des anticorps primaires à la suspension cellulaire afin d'obtenir la concentration finale souhaitée. Ici, des anticorps anti-CD20 conjugués à la PE Texas Red sont utilisés pour marquer les cellules B, tandis que des anticorps anti-TCRβ conjugués à ZI et/ou des anticorps anti-CD4 conjugués à 700 sont utilisés pour marquer les cellules T, en mélangeant par de légers chocs sur le fond du tube ou par agitation douce.

Vortexez, puis placez les cellules sur de la glace et incubez à l’obscurité pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, lavez les cellules marquées par resuspension, en les suspendant dans 10 millilitres de tampon de suspension glacé, puis centrifugez comme précédemment, après avoir soigneusement éliminé le surnageant. Répétez cette étape afin de laver les cellules une deuxième fois.

Enfin, resuspendre les cellules dans du tampon de resuspension glacé. Si les anticorps primaires ne sont pas directement conjugués à un fluorochrome, ajouter des anticorps secondaires marqués ou de la streptavidine conjuguée à la suspension cellulaire, puis incuber à nouveau les cellules sur glace à l'abri de la lumière pendant 20 à 30 minutes après l'incubation. Laver les cellules deux fois avec du tampon de resuspension glacé.

Après avoir resuspendu les cellules dans un tampon de resuspension glacé, déterminez la concentration cellulaire et la viabilité à l’aide d’un colorant vital tel que le bleu de trypan et d’un hémocytomètre. Ajustez la concentration cellulaire à 10 à 20 × 10⁶ cellules par millilitre en ajoutant du tampon de resuspension, afin d’éviter d’obstruer le trieur cellulaire avec des agrégats de cellules qui auraient pu mourir pendant l’isolement.

Procédure et coloration. Filtrer les cellules à l’aide d’un tamis à goutte à goutte immédiatement avant de commencer le protocole de tri. La taille des pores du tamis doit être choisie en fonction du type cellulaire ; pour les cytes, un tamis avec une taille de pore de 40 micromètres est utilisé.

Recueillir les cellules filtrées dans un tube conique de 15 litres ou dans des tubes d'écoulement de 12 par 75 millimètres, selon le volume. Placer ensuite les cellules sur de la glace pendant la mise en place du cytomètre pour la procédure de tri. Si l'on utilise des billes de compensation BD comme témoins positifs monocolorés, préparer un tube témoin pour chaque couleur utilisée dans le test, ainsi qu'un tube témoin négatif non coloré.

Après avoir vortexé soigneusement les suspensions de billes, ajouter une goutte de chaque suspension de billes, négative et positive, à une suspension tampon de 100 microlitres pour chaque couleur utilisée ainsi que pour le témoin négatif. Ensuite, ajouter un microlitre de l'anticorps marqué à chaque tube de témoin positif. Dans cette expérience, un tube est préparé en utilisant des anticorps PE Texas'Red B deux 20.

Un avec des anticorps anti-ETCR bêta et un autre avec des anticorps anti-CD4 lor 700, mélangés en agitant doucement le fond des tubes, puis incubés de 15 à 30 minutes à l'abri de la lumière à température ambiante. Laver les billes une fois avec deux millilitres de tampon de marquage et centrifuger à 200 ×g pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre le culot de billes dans 200 à 500 microlitres de tampon de marquage.

La configuration du tampon du cytomètre en flux varie selon le fabricant et ne doit être effectuée que par du personnel convenablement formé. La procédure de tri cellulaire décrite ici sera réalisée à l'aide du BD defects aria. Avant le tri, sélectionnez le喷嘴 approprié en fonction du type de cellule à trier.

Les tailles disponibles pour la buse sont 70 micromètres, 100 micromètres et 130 micromètres. La taille de la buse doit être d'au moins trois fois la taille de la cellule à trier ; pour les lymphocytes, on choisit la buse de 70 micromètres. Le tri cellulaire aseptique peut être effectué à l’aide de l’option de tri aseptique de l’appareil.

En utilisant cette option, tout le trajet du flux d'appoint est décontaminé avec de l'éthanol à 70 % conformément aux instructions du fabricant. Veillez à remplacer les filtres du flux d'appoint et à substituer le PBS par du PBS stérile. Une fois le cytomètre prêt à fonctionner, placez les tubes de collecte prérefroidis contenant du FCS en excès dans le dispositif de collecte approprié.

Les dispositifs de collecte disponibles peuvent contenir jusqu'à deux tubes coniques de 15 millilitres, quatre tubes de 12 par 75 millimètres ou quatre microtubes. Utilisez des tubes de 12 par 75 millimètres pour la collecte de moins de 1,5 × 10⁶ cellules et des tubes coniques de 15 millilitres pour la collecte de 1,5 × 10⁶ à 4,5 × 10⁶ cellules.

Placer le dispositif de collecte approprié dans la chambre de tri. Diriger les flux latéraux vers le dispositif de collecte installé pour les tris multicolores. Le cytomètre doit d'abord être calibré afin de tenir compte du recouvrement spectral entre les détecteurs.

L'exemple illustré ici montre le recouvrement entre les spectres d'émission de l'FITC et du PE. Ce recouvrement, indiqué par la zone ombrée foncée, est appelé « spillover ». Ici, le « spillover » du PE serait détecté sur le canal FITC et le « spillover » du FITC serait détecté sur le canal PE.

Ce débordement doit être corrigé afin d'éliminer la fluorescence résiduelle d'un fluorophore dans un autre canal. Le processus de correction du débordement s'appelle la compensation, permettant d'effectuer une compensation manuelle. Utilisez un logiciel de cytométrie pour configurer un modèle comprenant un diagramme bivarié affichant la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC), ainsi qu'un histogramme pour chaque fluorophore qui sera utilisé.

La méthode de configuration de ces graphiques varie selon le logiciel utilisé. Placer le tube témoin négatif com dans le port de chargement du cytomètre et commencer l'acquisition des données pendant que l'échantillon circule. Régler le FSC et le SSC afin de positionner la population d'intérêt à l'échelle appropriée.

Ensuite, ajustez les paramètres du PMT de fluorescence pour positionner la population négative ou l'autofluorescence dans la partie extrême gauche de l'histogramme. Enregistrez le tube témoin négatif. Retirez le tube témoin négatif du port de chargement du cytomètre et remplacez-le par le premier tube témoin positif.

Commencez maintenant l'acquisition. Répétez ce processus pour chacun des tubes témoins positifs en enregistrant les données de chaque tube. Pour chaque témoin positif, dessinez une fenêtre d'intervalle ou un cadre autour des événements enregistrés sur l'histogramme.

Ensuite, dessinez une autre porte d'intervalle dans la partie négative de l'histogramme. Lors de la compensation manuelle, tenez compte de chaque fluorochrome utilisé dans l'expérience en ajustant la médiane des positifs jusqu'à ce qu'elle soit égale à celle des négatifs. Pour ajuster la médiane, modifiez les valeurs de recouvrement spectral, soit en les augmentant soit en les diminuant, jusqu'à ce que les médianes de chaque paramètre fluorescent correspondent le plus possible.

À l’aide des paramètres établis avec les échantillons de contrôle positif et négatif, préparez la procédure de tri en déterminant les réglages de débit pour l’échantillon expérimental. Placez le tube contenant les cellules à trier dans le port de chargement du cytomètre et commencez l’acquisition à une vitesse de 9 à 10 000 événements par seconde. Sélectionnez un diagramme de dispersion pour afficher la diffusion avant en fonction de la diffusion latérale.

L'angle de diffusion avant est un indicateur général de la taille cellulaire et est placé sur l'axe des abscisses, tandis que l'angle de diffusion latérale indique la granularité cellulaire et est placé sur l'axe des ordonnées. Définissez maintenant la population d'intérêt. Une fois les fenêtres définies, vérifiez que la température du port de chargement du cytomètre est réglée à quatre degrés Celsius.

Placez ensuite le tube de l'échantillon expérimental dans le port de chargement. Appuyez sur l'option de tri et commencez l'acquisition ; les tubes de collecte doivent être placés sur de la glace au fur et à mesure qu'ils se remplissent. Poursuivez le tri jusqu'à ce que le nombre souhaité de cellules ait été collecté ou jusqu'à ce que le tube d'échantillon soit vide.

Ensuite, arrêtez le tri en sélectionnant à nouveau le bouton de tri et retirez l'échantillon du port de chargement. Puis, placez le tube de collecte directement sur le port de chargement du cytomètre et acquérez entre 500 et 1000 événements. En utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour le tri des cellules T, le procédé de tri a permis d'augmenter la pureté de 21 à 99 %. Pour les cellules B, la population initiale de cellules B de 5 % est passée à 98 % après tri.

Nous venons donc de vous montrer comment purifier les populations de cellules B et T à partir de cytes par fax. N'oubliez pas que la cytométrie en flux peut être utilisée pour purifier n'importe quelle population cellulaire, à condition qu'une suspension de cellules individuelles puisse être obtenue et que des anticorps appropriés soient disponibles. De plus, les cellules marquées génétiquement par des marqueurs fluorescents peuvent facilement être purifiées sans recourir à des anticorps.

De plus, n’oubliez jamais d’utiliser les contrôles appropriés pour vos expériences et vérifiez toujours la configuration des lasers de votre cytomètre en flux afin de vous assurer d’utiliser les fluorochromes corrects, ainsi que des portes adéquates, positionnées correctement autour de vos populations. Voilà tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.