Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées In situ

En combinant l'hybridation in situ et la coloration par tétramère dans une technique appelée ISTH, on peut déterminer les nombres relatifs et les relations spatiales entre les cellules effectrices immunitaires spécifiques de l'antigène viral et les cellules et tissus infectés par le virus. L'ISTH commence par l'encapsulation de tissus infectés par le SIV frais dans de l'agarose. Le tissu est découpé en sections de 200 microns d'épaisseur à l'aide d'un vibrotome et coloré pour l'antigène viral.

Des cellules spécifiques CD8+ à l’aide de tétramères MHC marqués avec du fit C. Après congélation, ces échantillons colorés sont ensuite découpés en sections de huit micromètres d'épaisseur à l'aide d'un cryostat, et une hybridation in situ est réalisée pour localiser les cellules infectées par le virus. Une microscopie confocale est utilisée pour imager les sections doublement colorées et, en fin de compte, reconstruire les sections épaisses d'origine afin de révéler la relation entre les cellules effectrices immunitaires et les cellules cibles.

L'utilisation de cette procédure pour examiner l'infection précoce par le SIV s'est révélée être un bon prédicteur de la gravité de la maladie qui s'ensuit. Bonjour, je suis Chinen Lee du laboratoire d'Ashley Ha du Département de microbiologie de l'Université du Minnesota. Je suis Pam Skinner, professeure adjointe au Département des sciences biomédicales vétérinaires de l'Université du Minnesota.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'hybridation in situ combinée à la coloration par tétramère, ou ISTH pour faire court. En plus d'utiliser la coloration par tétramère in situ combinée à l'hybridation in situ comme nous le démontrons aujourd'hui, nous utilisons couramment la coloration par tétramère in situ combinée à l'immunohistochimie afin de déterminer la localisation, l'abondance et le profil d'expression protéique des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène directement sur tissu. Pour nous aider aujourd'hui avec la coloration par tétramère in situ sur coupes épaisses, nous aurons le Dr Heon Kim et Terry Matala, et pour la préparation des coupes minces et l'hybridation in situ, nous aurons

Pour commencer cette procédure, refroidir le bain Vibram contenant du PBSH stérile à environ deux degrés Celsius. Régler l'angle de la lame du vibreur à 27 degrés. Dans la mesure du possible, maintenir les tissus frais au froid sur de la glace et commencer la procédure dans les 24 heures suivant la récolte des tissus.

Pour minimiser la dégradation due au refroidissement, le vibram facilite également la découpe d'un tissu frais : retirez le tissu conjonctif et découpez l'échantillon en petits morceaux à l'aide d'un scalpel, puis placez les morceaux dans un bateau en whey et recouvrez-les d'agarose à faible point de fusion à 4 % dans du PBS, fondue à environ 40 degrés Celsius. Veillez à ce que le tissu soit en contact avec le fond de la boîte et appuyez sur les morceaux de tissu s'ils flottent ; laissez durcir sur glace pendant trois à cinq minutes.

Ici, on utilise un tissu splénique, mais un ganglion lymphatique, le vagin, le col de l'utérus, l'utérus ou d'autres tissus frais peuvent également être utilisés avec un scalpel. Coupez les agaroses autour du tissu et, à l'aide de pinces, transférez soigneusement le tissu inclus dans l'agarose vers le bloc de tissu. Continuez ensuite par recouvrir un bloc de tissu Vibram de colle Loctite.

Ne pas déplacer le fragment de tissu une fois qu'il est posé sur le bloc de tissu. Laisser sécher environ 10 minutes sur de la glace. Ensuite, monter le bloc de tissu sur le vibrotranche et couper le tissu en sections de 200 micromètres d'épaisseur en utilisant une vitesse d'avance très lente et une amplitude relativement élevée.

Utilisez un pinceau pour transférer les sections découpées dans une chambre à tissus spécialisée placée dans la cavité d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits préremplie avec un millilitre de PBSH glacé. Placez jusqu'à quatre sections de tissu dans chaque chambre à tissus. Étiquetez les échantillons et fixez le couvercle sur la plaque à l'aide d'un élastique afin de colorer les sections de tissu pour les lymphocytes T spécifiques du virus.

Les tétramères conjugués à la ZI sont d'abord dilués dans du tampon de blocage à environ 0,5 microgramme par millilitre. La solution est pipetée dans une plaque de 24 puits à raison d'un millilitre par puits. Le tissu fraîchement découpé est transféré dans la plaque, dans les chambres à tissus, et est laissé agiter toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Conserver un puits vide entre les chambres de tissus contenant des échantillons différents afin d'éviter toute contamination croisée des solutions lors des étapes suivantes. À cette étape, on peut ajouter des anticorps dirigés contre des protéines extracellulaires ou de surface cellulaire. Pour les lavages, préparer une plaque de culture tissulaire à 24 puits contenant du PBSH froid après l'incubation primaire.

Lavez deux fois en transférant les chambres tissulaires vers une plaque préremplie pendant 20 minutes à chaque fois ; veillez à évacuer la majeure partie du liquide des chambres tissulaires avant le transfert. De plus, évitez de faire tomber le contenu d'un échantillon dans un autre lors du déplacement des chambres tissulaires, et surveillez les sections dans les chambres tissulaires afin de vous assurer qu'elles ne s'attachent pas aux parois. Fixez les sections avec du paraformaldéhyde frais à 4 % dans du PBS pendant deux heures à température ambiante après la fixation.

Laver deux fois avec du PBSH froid pendant cinq minutes chaque fois afin d'amplifier le signal provenant des tétramères. Incuber les sections avec des anticorps anti-fitzy de lapin à un ratio de un pour 10 000 dans du tampon de blocage pendant un à trois jours. À cette étape, on peut ajouter des anticorps dirigés contre des épitopes intracellulaires.

Veiller à perméabiliser les cellules et bloquer les sites non spécifiques avant l'ajout de l'anticorps. Une récupération de l'antigène peut également être nécessaire après la deuxième incubation prolongée destinée à amplifier le signal. Laver les sections dans du PBSH trois fois, pendant au moins 20 minutes et jusqu'à plusieurs heures à chaque fois.

Réalisez une incubation finale avec les anticorps marqués par un fluorochrome approprié. Par exemple, on peut utiliser de la chèvre anti-lapin SI trois pour lier les anticorps anti-fitzy de lapin et rendre les cellules marquées par le tétramère fluorescents en rouge. Si des anticorps de souris ont été utilisés pour une contre-coloration de protéines d'intérêt, comme le CD huit afin de visualiser les lymphocytes T cytotoxiques, on peut utiliser de la chèvre anti-souris Alexa 488 pour se lier aux anticorps de souris et rendre la coloration par anticorps fluorescente en vert. Les dilutions de chaque anticorps doivent être déterminées empiriquement.

Incuber pendant un à trois jours en protégeant les sections de la lumière en enveloppant les plaques dans du papier d’aluminium pendant cette incubation et par la suite, car la lumière éteint les fluorophores. Enfin, fixer à nouveau les sections pour stabiliser les tétramères et les anticorps en place. Rincer et monter sur une lame de microscope avec une gélatine glycérinée contenant quatre milligrammes par millilitre de N-propylgallate, puis conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à la préparation de coupes minces pour l’hybridation in situ.

Les sections colorées par la technique du tétramère en place peuvent désormais être analysées au microscope confocal afin de déterminer la localisation, l'abondance et le profil d'expression protéique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène. Sur l'image présentée, des sections de tissu splénique provenant d'un macaque rhésus infecté par le SIV ont été marquées avec des tétramères gag pour révéler les lymphocytes T CD8+ spécifiques du SIV, ainsi qu'avec des anticorps dirigés contre CD20 et CD3. Étant donné que la contre-coloration par anticorps sera perdue à l'étape suivante, il est important d'analyser les tétramères en place avant de poursuivre.

Commencez la procédure de coupe mince en chauffant les sections de 200 micromètres d'épaisseur à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un bloc chauffant afin de détacher les sections épaisses de la lame. Une fois les sections détachées, incluez-les dans l'OCT sur de la glace sèche en remplissant d'abord le fond du moule en plastique avec de l'OCT. Ensuite, placez le tissu au-dessus de l'OCT et recouvrez-le d'OCT.

Utilisez un cryostat pour découper des sections de huit micromètres d'épaisseur à partir des échantillons inclus dans l'OCT et fixez les sections de huit micromètres sur des lames silanisées. Les lames peuvent ensuite être conservées à moins 80 degrés Celsius dans une boîte hermétique en vue d'une hybridation in situ ultérieure. Une hybridation in situ standard est utilisée pour détecter les cellules infectées par le virus à l'aide de sondes ribonucléiques spécifiques du virus marquées au S 35.

La procédure comprend également le recouvrement des coupes avec une émulsion sensible aux traces nucléaires et le montage des lames. Des images confocales sont acquises dans un milieu paraffiné compatible avec la fluorescence à l’aide d’un microscope confocal BioRad MRC 1000, équipé d’un dispositif de réflexion épi-tube bleu. La coloration par tétramère in situ est visualisée à l’aide de l’EPI un 605 pour le fluorochrome rouge du tétramère et de l’EPI 2 522 DF 32 pour le fluorochrome vert du CD huit destiné à l’hybridation in situ.

Utilisez la réflexion bleue EPI pour les grains d'argent résultant du signal d'hybridation in situ sur les autoradiographies développées. Pour commencer l'acquisition d'images, acquérez les images de chaque section de gauche à droite et de haut en bas, en veillant à capturer chaque image avec un chevauchement d'environ 20 % par rapport aux images adjacentes. Afin d'éviter des espaces vides dans l'image-montage reconstituée, nommez chaque image selon sa ligne et sa colonne dans un fichier Excel.

Lorsque la collecte de données à partir des lames est terminée, utilisez le logiciel d'assistance confocal pour projeter les images sérielles en Z pour chaque canal en une seule image à l'aide d'une procédure d'action Photoshop version sept disponible auprès des auteurs, puis fusionnez automatiquement l'image projetée des trois canaux en une seule image RVB. Ensuite, assemblez les images fusionnées en couches pour générer une image-montage de toute la section. Associez individuellement les grains d'argent et la coloration par tétramère aux cellules présentes sur le montage à l'aide de MetaMorph ou de Photoshop.

Attribuez les coordonnées XY des centres ou des OID des cellules positives pour l'ARN viral et des cellules positives au tétramère. Exportez les données OID vers des fichiers Excel sous forme de nombres numériques pour chaque cellule, puis utilisez les données recueillies dans les fichiers Excel pour déterminer les rapports entre les cellules effectrices immunitaires (ou cellules E) et les cibles virales (ou cellules T), à partir du nombre total de cellules positives au tétramère et de cellules positives à l'ARN viral dans la section, afin de saisir les relations spatiales entre les cellules positives au tétramère et les cellules positives à l'ARN. Copiez et collez leurs graphiques respectifs depuis les fichiers Excel dans un document Photoshop dans Photoshop.

Réduisez l'opacité d'un calque pour aligner et redimensionner les grilles afin qu'elles coïncident par couleur, sélectionnez-les, puis copiez et collez-les dans un nouveau calque. Les positions des cellules positives pour l'ARN marquées en bleu permettent de supprimer le calque utilisé pour aligner les grilles, et les positions des cellules positives au tétramère et des cellules positives pour l'ARN viral apparaîtront sur l'image aplanie. En utilisant la méthode ISTH présentée ici, nous sommes en mesure de suivre la réponse immunitaire contre l'infection par le SIV après une inoculation intravaginale à ce point d'entrée, ainsi que dans les tissus lymphatiques où l'infection se propage.

Il y a un grand nombre de cellules infectées dans ces sites tissulaires à 10 jours post-infection, mais même trois jours plus tard, on observe des cellules positives au colorant vert CD A, mais pas encore de cellules positives au tétramère spécifique du SIV colorées en rouge. La réponse immunitaire est donc trop tardive pour éliminer l'infection.

Cependant, trois semaines après l'infection, une diminution des cellules infectées est clairement visible, en particulier au point d'entrée. Nous avons utilisé l'ISTH pour montrer que l'ampleur de cette réduction était corrélée à la proximité spatiale et aux nombres relatifs des cellules effectrices immunitaires tétramères positives. Les cellules cibles positives pour N-S-I-V-R-N-A, nous appelons cela le rapport E:T in vivo.

Les relations spatiales sont facilement visualisées à l’aide de cette méthode, les cellules effectrices apparaissant en rouge et les cibles virales en bleu dans ce ganglion lymphatique infecté. De nombreuses cellules effectrices et cibles sont en étroite proximité, et certaines zones présentent plusieurs cellules effectrices entourant une seule cellule positive pour l’ARN du S-I-V, tandis que dans d'autres zones, une cellule positive pour l’ARN du S-I-V est isolée. Le rapport E:T est simplement calculé à partir des positions des cellules, qui sont déterminées et enregistrées en fonction du nombre de chacune dans le fichier Excel.

Le meilleur contrôle de l'infection virale est corrélé à un excès important d'effecteurs rouges par rapport aux cibles vertes, dans un rapport de 43 pour 1. Dans ce cas, au niveau du col de l'utérus et du vagin où l'infection a débuté, les rapports ETT étaient plus faibles dans les ganglions lymphatiques. La corrélation positive entre des rapports ETT élevés et la réduction de la charge virale à partir du pic indique qu'une réponse immunitaire plus robuste au site d'entrée se traduit par un meilleur contrôle de l'infection.

Nous venons de vous montrer comment détecter simultanément les cellules CDAT très spécifiques et les cellules infectées par le virus in situ. Cette technique nous permet de visualiser simultanément les cellules T spécifiques de l'antigène et les cellules infectées par le virus dans les tissus. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer les vaccins basés sur les lymphocytes T CD8 positifs ainsi que les autres interactions hôte-pathogène non liées à une valeur lors de la réalisation de cette procédure.

Il est important de maintenir tous les réactifs exempts d'ARN avant les hybridations. Voilà. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.