Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c
4 novembre 2009
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Échantillons microvolume sont quantifiés par un système qui utilise un spectrophotomètre tension de surface naturelle à conserver des échantillons sans l'utilisation des cuvettes ou des capillaires. La gamme dynamique des concentrations de protéines et de la vitesse à laquelle ils peuvent être mesurés sont fortement augmentées avec cette méthode.
Aperçu
Le spectrophotomètre NanoDrop 2000 C utilise une technologie innovante pour mesurer des échantillons microvolume de protéines et d'acides nucléiques sans cuvettes traditionnelles. Cette méthode améliore la rapidité de mesure et la gamme dynamique, permettant une détermination efficace de la concentration en protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Chimie analytique
- Analyse des protéines
Contexte
- La technologie NanoDrop utilise des fibres optiques et la tension superficielle pour la rétention de l'échantillon.
- Elle permet la mesure directe de petits volumes d'échantillon (1-2 µL).
- L'élimination des cuvettes réduit les besoins en échantillon et le temps de nettoyage.
- Le système peut mesurer des concentrations élevées sans dilution.
Objectif de l'étude
- Montrer la procédure permettant de déterminer la concentration en protéines à l’aide du NanoDrop 2000 C.
- Mettre en évidence les avantages de la spectrophotométrie en microvolume.
- Fournir des directives pour utiliser l’appareil de manière efficace.
Méthodes utilisées
- Prélèvement d'échantillon directement sur le socle optique.
- Utilisation d'un blanc pour l'étalonnage avec un tampon approprié.
- Mesure de l'absorbance à 280 nm pour la concentration en protéines.
- Utilisation de dosages colorimétriques tels que le BCA pour les protéines non caractérisées.
Résultats principaux
- Le NanoDrop 2000 C fournit des mesures rapides et précises de la concentration en protéines.
- La tension superficielle retient efficacement les échantillons en microvolume pour l'analyse.
- L'ajustement en temps réel de la longueur de trajet améliore la précision des mesures.
- Un nettoyage minimal de l'échantillon est requis entre les mesures.
Conclusions
- Le NanoDrop 2000 C est un outil précieux pour l'analyse des protéines en milieu de recherche.
- Son design simplifie le processus de mesure et réduit le gaspillage d'échantillons.
- Les méthodes colorimétriques élargissent son applicabilité à divers types d'échantillons protéiques.
Questions fréquemment posées
Quel est l'avantage principal de l'utilisation du NanoDrop 2000 C ?
Le principal avantage réside dans sa capacité à mesurer des échantillons en microvolume sans cuvettes, permettant ainsi une détermination plus rapide et plus efficace de la concentration en protéines.
Quelle quantité d'échantillon est nécessaire pour la mesure ?
Seulement 1 à 2 microlitres d'échantillon sont nécessaires pour la mesure.
Le NanoDrop 2000 C peut-il mesurer des échantillons à forte concentration ?
Oui, il peut mesurer des concentrations élevées sans nécessiter de dilution grâce à sa longueur de trajet ajustable.
Quels types d'échantillons peuvent être analysés ?
Il peut analyser les protéines et les acides nucléiques, en particulier ceux contenant des résidus spécifiques qui absorbent à 280 nm.
Quelle méthode de nettoyage est recommandée pour les plots optiques ?
Il est recommandé d'utiliser un chiffon de laboratoire sec pour nettoyer les surfaces optiques entre les mesures.
Existe-t-il des solvants qui ne doivent pas être utilisés avec le NanoDrop ?
Oui, les solutions d'acide fluorhydrique et les réactifs contenant des agents tensioactifs ne doivent pas être utilisés, car ils peuvent affecter les surfaces de mesure.
Pertinence industrielle pour les cadres
La quantification de protéines en microvolume répond au défi de la disponibilité limitée des échantillons lors de la phase initiale de découverte, permettant une validation précise des cibles avec une quantité minimale de matériau. Le NanoDrop 2000c renforce la fiabilité prédictive en fournissant rapidement des données de concentration reproductibles, sans dilution, soutenant ainsi les décisions de poursuite ou d'abandon lors de l'identification des candidats prometteurs. Son ajustement en temps réel de la longueur de trajet optique et sa large gamme dynamique améliorent la standardisation des essais au sein des flux de travail de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse d'échantillons protéiques purifiés à l'aide de l'absorbance à 280 nm pour une évaluation rapide de l'expression et de la pureté.
- Valeur opérationnelle : Réduit la consommation d'échantillon à 1-2 µL, préservant ainsi les matériaux précieux pour des essais ultérieurs.
- Valeur prédictive : Facilite la validation fonctionnelle de la cible en fournissant des concentrations précises nécessaires aux études d'activité et de liaison.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Facilite la préparation d'entrées protéiques normalisées pour les dosages biochimiques et cellulaires grâce à une quantification précise.
- Valeur opérationnelle : Élimine l'utilisation de cuvettes et les étapes de dilution, accélérant ainsi la mise en place des dosages et améliorant la reproductibilité.
- Évolutivité : Permet une préparation à haut débit grâce à des mesures rapides et à un protocole de nettoyage simple par essuyage entre chaque échantillon.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs en permettant la quantification d'échantillons et d'étalons protéiques dans des dosages fondés sur la méthode BCA.
- Pertinence pour les modèles précliniques : Assure une administration précise des doses dans les études fonctionnelles en fournissant des données fiables de concentration pour les lysats et extraits.
- Progression ajustée au risque : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études d'engagement ciblé grâce à une normalisation précise des protéines.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le NanoDrop 2000c s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés actifs et l'évaluation préclinique, en assurant une quantification cohérente des protéines à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Facilite la validation d'hypothèses en permettant une normalisation précise des échantillons protéiques dans les études de voies et d'interactions.
- Écrans : Fournit des entrées protéiques reproductibles et prêtes à l'emploi pour des tests enzymatiques, de liaison et fonctionnels.
- Analytique : Offre des mesures quantitatives à 280 nm et colorimétriques permettant des comparaisons entre différentes conditions et échantillons.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la recherche préclinique grâce à une quantification fiable dans les dosages BCA pour les courbes standards et l'analyse d'échantillons.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme partagée et réutilisable de quantification protéique pour de multiples projets et équipes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant la variabilité de la quantification des protéines en entrée.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité grâce à un ajustement automatisé de la longueur de trajet optique et à une manipulation minimale des échantillons.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en minimisant le gaspillage d'échantillons et en accélérant les délais de mesure.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque grâce à des données fiables de concentration pour les décisions d'orientation (aller/ne pas aller) lors de l'optimisation des candidats.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation de base en laboratoire aux techniques de pipetage et de manipulation d'échantillons pour les méthodes en microvolume.
- Suppose l'accès à un spectrophotomètre NanoDrop 2000c et à des lingettes de laboratoire compatibles pour l'entretien des surfaces.
- Exige une standardisation entre les équipes concernant les procédures de blanc et l'adéquation des tampons afin d'obtenir des résultats précis.
- Implique des adaptations pour les échantillons visqueux ou contenant des agents tensioactifs, qui peuvent affecter la formation de la colonne dépendante de la tension superficielle.
- Comprend des limitations pratiques, telles que l'incompatibilité avec l'acide fluorhydrique et les réactifs riches en tensioactifs, pouvant dégrader les surfaces optiques avec le temps.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Pourquoi la mesure de l'absorbance à 280 nm est-elle importante pour la validation de la cible ?
L'absorbance à 280 nm permet une quantification rapide et sans marquage des protéines purifiées contenant des résidus de tryptophane, de tyrosine ou de cystéine, fournissant une information essentielle pour évaluer les niveaux d'expression et la pureté dans les protocoles précoces de validation ciblée.
Comment l'échantillonnage en microvolume s'intègre-t-il au processus de découverte des protéines ?
L'échantillonnage en microvolume utilisant 1 à 2 µL d'échantillon préserve les échantillons limités provenant de systèmes d'expression ou de purifications, permettant ainsi la quantification sans compromettre les échantillons nécessaires aux essais fonctionnels ou structuraux en aval.
Quel est l'avantage du réglage en temps réel de la longueur du trajet optique dans la quantification des protéines ?
Le réglage en temps réel de la longueur de trajet optique permet au NanoDrop 2000c de mesurer des échantillons protéiques concentrés sans dilution, élargissant ainsi la gamme dynamique et garantissant des mesures précises pour divers types d'échantillons.
Pourquoi les exigences de réplication sont-elles importantes pour la collaboration transversale ?
Les exigences en matière de réplication garantissent des données de concentration en protéines cohérentes et reproductibles entre les utilisateurs et les laboratoires, permettant une comparaison fiable des résultats dans les efforts de validation ciblée et de développement de tests.
Quelle analyse statistique est nécessaire avant de mettre en œuvre la quantification par dosage BCA ?
La mise en œuvre de la quantification par dosage BCA nécessite la génération d'une courbe standard à partir d'étalons de référence afin de permettre l'interpolation précise des concentrations d'échantillons inconnus, une étape indispensable à une mesure fiable de la concentration en protéines dans des lysats ou des extraits.
