Ingénierie cellulaire perméable protéines

La manipulation de la fonction cellulaire peut être réalisée par les approches classiques de transfection d'ADN ou de transduction virale au cours des 15 dernières années. Une autre méthode s'est développée. La protéine biologiquement active peut être directement introduite dans les cellules de mammifères à l'aide de petits peptides fusionnés à la protéine d'intérêt, ce qui favorise l'absorption cellulaire.

Étant donné qu'aucun ADN n'est utilisé, le risque d'agenèse par exercice est évité. Contrairement aux méthodes classiques mentionnées ci-dessus. La transduction de protéines permet une délivrance de protéines de manière titrable.

De plus, de petites populations cellulaires ainsi que des cellules non divisantes, telles que les neurones post-mitotiques, peuvent être modulées. Pour exprimer efficacement une protéine recombinante, nous recommandons l'utilisation du système vectoriel Paciz. Il s'agit d'un système vectoriel modulaire composé d'une variante en extrémité N-terminale et d'une variante en extrémité C-terminale.

Les deux vecteurs permettent l'insertion facile de votre gène d'intérêt à des fins de purification. Une étiquette d'histidine est intégrée, ainsi qu'un domaine de transduction protéique. Dans notre cas, un fragment du virus HI favorise l'absorption cellulaire pour une distribution intracellulaire.

Un signal de localisation nucléaire complète le vecteur ; pour des raisons de contrôle, les étiquettes de fusion peuvent simplement être retirées. En outre, la disposition de ces étiquettes peut avoir une influence majeure sur les propriétés des protéines de fusion. L'impact sur le rendement et la pureté, ainsi que sur la commercialisabilité et la fonction biologique, n'est pas prévisible.

Bonjour, je m'appelle Bernard Mus et je travaille au sein du groupe d'ingénierie des cellules souches de l'Institut de neurobiologie reconstructive à Bonn, en Allemagne. Bonjour, je m'appelle Christoph P et je fais également partie du laboratoire Hoover. Notre équipe utilise intensivement la technique de transduction de protéines pour délivrer directement des protéines biologiquement actives dans diverses cellules de mammifères, et aujourd'hui, nous allons vous guider à travers le processus d'expression et de purification in et from e coli.

Par la suite, nous souhaitons vous montrer comment appliquer une protéine de fusion cellulaire permanente en culture cellulaire afin d'illustrer l'ensemble du procédé d'expression, de purification et d'application. Nous utilisons la recombinaison spécifique au site Cre pour modifier génétiquement des cellules souches embryonnaires murines. D'accord. D'accord. Commençons.

Pour ensemencer la culture de nuit, nous utilisons des bactéries déjà transformées, conservées dans un stock de glycérol à moins 80 degrés Celsius. Ces bactéries contiennent déjà le vecteur codant pour la recombinaison decre. À l’aide d’une pipette, nous prélevons une petite quantité de bactéries sur la pointe de pipette et la déposons dans le bécher contenant la culture de nuit.

La culture de nuit est composée de milieu LB supplémenté avec du glucose à une concentration finale de 0,5 % et de 50 microgrammes d'insuline carbonique par ml. Le bécher est ensuite placé dans un incubateur fonctionnant à 37 degrés Celsius pour l'expression de la Recombinate Cree spécifique au site. Nous utilisons un milieu TB pré-induit pour notre culture d'expression à grande échelle.

Pour accélérer l'expression, nous recommandons l'utilisation d'un milieu TB préchauffé à 37 degrés Celsius, qui correspond à la température d'expression de la protéine recombinante. Ensuite, nous ajoutons du glucose au milieu TB à une concentration finale de 0,5 % afin d'éviter une expression basale accrue de la protéine de fusion pendant la croissance de la culture d'expression avant l'induction. Enfin, de l'ampicilline est ajoutée à la culture d'expression à une concentration finale de 100 microgrammes par ml afin de garantir une culture pure ne contenant que les bactéries qui possèdent encore le plasmide codant pour la protéine Decree.

Nous pouvons maintenant récupérer notre culture de nuit et ensemencer la culture d'expression dans un rapport de un à 50. Les béchers sont ensuite transférés dans un incubateur fonctionnant à une température de 37 centigrades. Vous devez prélever des échantillons pour mesurer la densité optique de manière régulière tout au long de l'expression.

Dès que la culture a atteint une densité optique de 1,5, les bactéries sont induites avec une concentration finale de 0,5 millimolaire d'IPTG. Après une heure d'induction, la culture d'expression est transférée dans des tubes et ensuite récoltée par centrifugation. À cet effet, nous utilisons un rotor SLA 3000.

La centrifugeuse tourne à une vitesse de 5 000 tours par minute pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Le surnageant est ensuite éliminé et le culot bactérien peut être conservé indéfiniment à moins 20 degrés Celsius. Les culots congelés sont redispersés dans du tampon lizza, un volume équivalent à un litre de culture d'expression.

Nous utilisons 10 ml de tampon lizza et attendons environ 15 minutes jusqu'à ce que la solution devienne homogène. Un milligramme de lysozyme est ensuite ajouté par chaque ml de suspension. La solution est mélangée pendant 20 minutes afin de permettre à l'enzyme de lyser les bactéries.

Ensuite, du Benson Nase est ajouté à une dilution de un à 1000 pendant encore 15 minutes, ce qui coupe l'ADN et donne une solution non visqueuse. Enfin, un sonateur est utilisé pour assurer la lyse des cellules. Le programme fonctionne pendant une minute et demie avec une puissance de 45 % après la fin de la certification.

N'oubliez pas de prélever un échantillon à chaque étape ici, le lysat brut ou l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE de la purification. Il est maintenant très important d'ajouter un ml de tampon TSB glacé par ml de suspension, car la protéine decree aura tendance à précipiter dans le stock de glycérol. Si vous prévoyez de sauter cette étape, mélangez brièvement la solution, et le brut est désormais prêt pour la centrifugation.

À cette fin, nous utilisons un rotor SS 34. La centrifugeuse tourne à 17 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois terminé, la centrifugeuse est arrêtée avec précaution et le surnageant S est transféré dans de nouveaux tubes Falcon de 50 ml.

Ajoutez maintenant une suspension de nickel anti-A au surnageant contenant du nickel. L'anti-A est un réactif essentiel pour la purification adéquate des protéines de fusion portant une étiquette histidine. L'histidine forme un complexe avec les ions nickel, permettant ainsi une purification par affinité. Agitez doucement les tubes sur un agitateur rotatif pendant 60 minutes à 40 degrés Celsius.

Après une heure, vous pouvez maintenant appliquer la suspension sur des colonnes de 20 ML et laisser la solution s’écouler par gravité. Pour les productions à grande échelle, il est possible de répartir la suspension sur plusieurs colonnes. Ensuite, nous lavons la colonne deux fois avec un tampon contenant 15 millimolaire d’innersole.

La quantité de tampon utilisée dépend du volume de résine. Deux MLS de nickel NTA correspondent à un ml de résine pour les besoins du lavage. Nous ajoutons cinq volumes de résine de tampon de lavage sur la colonne ; après le lavage, nous sommes maintenant prêts à éluer notre protéine.

Par conséquent, nous utilisons un tampon d'élution contenant une concentration de 250 millimolaire d'immuno. Remarquez comment la couleur de la résine vire au vert. En raison des concentrations élevées de la protéine CRE, la fraction OID devient parfois marron foncé.

Pour éviter cela, mélangez la solution et ajoutez du tampon de lyse supplémentaire ; toutes les fractions sont désormais regroupées, puis transférées dans un tube de lyse. La lyse permettra d’éliminer l’olé. La première étape de dialyse est effectuée contre un tampon contenant une concentration élevée de sel. Après une heure, le tampon riche en sel est remplacé et la procédure de dialyse est poursuivie toute la nuit.

Le lendemain, le tube de dialyse est retiré du tampon à haute teneur en sel et transféré dans un tampon au glycérol. Après trois à cinq heures, le tampon au glycérol est remplacé et la dialyse est à nouveau effectuée toute la nuit. La lyse dans le tampon au glycérol permet d'obtenir une solution mère concentrée d'au moins trois fois.

La solution mère peut désormais être conservée à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs années sans perte d'activité. Pour assurer la qualité, vous pouvez charger vos échantillons recueillis de PAGE au SDS sur un gel et le colorer par la suite. Pour Kamasi, la protéine de fusion Cree est détectable sous forme d'une bande marquée dans la fraction OID. Afin d'utiliser la concentration appropriée de recombinaison Crew, vous devez déterminer la concentration par dosage Redford.

Comment appliquer des protéines de façon permanente dans des cellules de mammifères. Tout d'abord, préparez vos cellules cibles afin d'obtenir les rendements les plus élevés en termes d'efficacité de transduction protéique. Observez les cellules en couche unique à une densité permettant d'obtenir une confluence de 80 à 90 % le jour suivant, dans le cas où vos cellules cibles seraient des cellules YES, cultivées en colonies compactes.

Séparez les cellules somatiques et obtenez une suspension monocellulaire cinq heures à l'avance. Il est important de préparer une suspension monocellulaire avant la transduction protéique, car sinon seules les cellules aériennes situées à la surface d'une colonie peuvent être transfusées. Aspirez le milieu et rincez brièvement les cellules aériennes avec du PPS avant d'appliquer le traitement.

Retirez complètement le milieu Yes contenant du sérum. Après avoir aspiré la couche de PPS recouvrant les cellules en laissant couler, laissez-les incuber trois à cinq minutes. Vérifiez maintenant au microscope si toutes les colonies se sont dissociées en cellules individuelles.

Les raisons mentionnées ci-dessus rendent cette étape cruciale pour la transduction protéique dans les cellules oui. Transférez les cellules détachées dans un tube. Placez le tube dans un centrifugeuse et centrifugez pour former un culot cellulaire. Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules.

Dans le milieu de croissance, diluez les cellules à un nombre approprié. Cela dépend bien sûr de la taille de la culture tissulaire. Incubez les cellules en milieu aérien pendant cinq heures supplémentaires.

Cela permettra aux cellules aériennes d'avoir suffisamment de temps pour s'attacher au fond et devenir adhérentes. Un stock de trois lignées cellulaires peut être conservé à moins 20 degrés pendant plus de deux ans. Lorsque l'on travaille avec une protéine de fusion recombinante stable, il est très avantageux de disposer d'une telle solution stock pouvant être utilisée à la demande.

Pendant que les cellules s'attachent à la boîte, on peut préparer le milieu de transduction C en diluant simplement un volume approprié de protéine de migration cellulaire permanente à partir du stock de cholestérol dans le milieu. Étant donné que la solution mère de Clare n'est pas encore stérile, le milieu de transduction doit être filtré stérilement avant son utilisation. Nous recommandons d'utiliser une seringue pouvant être vissée sur un filtre de liaison des protéines à lobe.

La concentration finale en creek dépend du type cellulaire ou des suppléments ajoutés au milieu. Par exemple, le sérum exerce une influence négative marquée sur l'efficacité de la transduction. Ce phénomène peut être contrecarré en utilisant un milieu sans sérum ou en augmentant la concentration en creek.

Nous déterminons la condition optimale permettant l'efficacité maximale de recombinaison. Hydrater la concentration du décret à partir de 0,5 jusqu'à 10 micromolaires. Nous recommandons de tester différentes durées d'incubation comprises entre six et 18 heures.

Après cinq heures d'incubation, retirez vos cellules cibles et aspirez le milieu de croisement. Ensuite, remplacez-le par du milieu de transduction protéique, puis remettez les cellules aériennes dans l'incubateur après une incubation nocturne. Lavez brièvement les cellules D avec du PPS et remplacez le milieu de transduction protéique par du milieu ES normal.

48 heures après l'incubation, l'expression du gène permanent de cellules Cree peut être détectée par xul. Les cellules colorées présentant un phénotype bega positif ont été correctement modifiées génétiquement par recombinaison spécifique au site. Cree le rapport.

Les cellules contiennent le construct CRE utilisant la construction Lae après recombinaison préalable. Une séquence d'arrêt flanquée par P est excisée et un gène rapporteur luxe est activé sous le contrôle du promoteur team. Afin d'évaluer l'efficacité de la recombinaison dans les cellules rapporteuses prétraitées, les cellules doivent être fixées.

Aspirez le milieu, lavez les cellules deux fois avec du PBS, recouvrez les cellules avec du PFA à 4 % et incubez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez à nouveau les cellules trois fois avec du PBS. Après avoir aspiré le PBS à l’issue de la dernière étape de lavage, ajoutez la solution de coloration Xal aux puits et incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés dans un incubateur.

Le jour suivant, l'activité Beal peut être surveillée par les cellules à col bleu. L'efficacité de la recombinaison peut être déterminée par le nombre de colonies bleues. Dans des conditions optimales, vous devriez être en mesure d'atteindre une efficacité de recombinaison supérieure à 90 %. Très bien, aujourd'hui nous vous avons montré comment exprimer et purifier la recombinaison spécifique de site à partir d’e. coli.

Dans cette étude de principe, nous avons pu induire une recombinaison dans la plupart des sels. Bon, c'est tout. Bonne chance avec vos expériences.I.