Mesure des coefficients de diffusion par deux photons de récupération de fluorescence après photoblanchiment

La fluorescence à plusieurs photons. La récupération après photobléaching est facilement démontrée à l’aide d’un échantillon de molécules de colorant fluorescent en diffusion libre. Premièrement, un faisceau laser de faible intensité est envoyé dans l’échantillon afin de générer un niveau de référence de fluorescence provenant des molécules D situées dans le volume focal du laser.

Ensuite, un bref flash laser de haute intensité est envoyé afin de photodétruire une partie des molécules de colorant dans le volume focal. Enfin, le faisceau laser est atténué au niveau d'intensité faible précédent et la fluorescence est surveillée tandis que les molécules photodétruites diffusent vers l'extérieur et sont remplacées par des molécules encore fluorescentes provenant de l'extérieur du volume focal. La courbe de fluorescence résultante en fonction du temps est analysée pour déterminer le coefficient de diffusion.

Bonjour, je suis Kelly Sullivan du laboratoire d'Edward Brown, du département de génie biomédical de l'Université de Rochester. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment réaliser une récupération de fluorescence après photobléachage multiphotonique. Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier la diffusion dans des systèmes biologiques in vitro et in vivo.

Commençons. Pour commencer, réglez la longueur d'onde laser souhaitée et insérez le filtre approprié devant le tube photomultiplicateur ou PMT. Ensuite, afin d'éviter d'endommager la cellule pcal, réglez la puissance laser à 200 milliwatts ou moins.

Deux miroirs orientés en forme de quatre sont situés en amont de la cellule pcal. Ces miroirs sont nécessaires et suffisants pour aligner le faisceau laser à travers la cellule pcal. Réglez le décalage de tension sur le contrôleur de polarisation de la cellule pcal à zéro, puis ajustez le trajet du laser à travers la cellule pcal de sorte que le laser soit centré dans les fenêtres avant et arrière.

Utilisez le miroir amont de la figure quatre pour centrer le faisceau dans la fenêtre avant et le miroir aval de la figure quatre pour centrer le faisceau dans la fenêtre arrière. Réglez maintenant la tension aux bornes du cristal de la cellule pcal à sa valeur maximale. La valeur appropriée dépend des longueurs d'onde et peut être trouvée dans le manuel d'instructions de la cellule pcal.

Réglez les miroirs situés en amont de la cellule pcal, conformément à la figure quatre, jusqu'à ce que la puissance de sortie de la cellule pcal soit maximisée. Appliquez ensuite une tension nulle aux bornes du cristal et ajustez le décalage de tension sur le contrôleur de polarisation afin de minimiser la puissance de sortie de la cellule pcal. Rétablissez la puissance laser incidente sur la cellule pcal à la valeur requise pour l'expérience.

Maintenant, passez au microscope et obtenez un bon focus visuel sur un échantillon fluorescent standardisé. Ici, nous utilisons des grains de pollen fluorescents fixes. Une fois le focus obtenu, fermez le microscope et réglez la puissance du laser à un niveau approprié pour l'imagerie de l'échantillon en modifiant la tension appliquée au cristal de la cellule pcal.

Enfin, éteignez les lumières et activez le PMT. Lancez une numérisation d'image répétée de l'échantillon standardisé et ajustez les miroirs en aval de la cellule pcal jusqu'à l'obtention d'une image nette de l'échantillon. Examinons maintenant la détermination des puissances de moniteur sûres pour le point de focalisation à l'intérieur de l'échantillon.

Pour les besoins de cette vidéo, nous utiliserons un échantillon de colorant aqueux contenu dans une dépression d'une lame de verre et recouvert d'une lamelle. Atténuez le laser à une puissance faible mais suffisante pour générer une fluorescence dans l'échantillon. Fermez hermétiquement le microscope et dérivez la sortie du PMT vers le compteur de photons.

Éteignez les lumières, activez le PMT et démarrez une analyse ponctuelle sur le logiciel du microscope. Réglez le compteur de photons pour intégrer sur une échelle de temps nettement plus longue que le temps de récupération de la fluorescence attendu, et enregistrez un nombre raisonnable de points de données. Augmentez la puissance et effectuez une autre série de mesures de comptage de photons.

Continuez à augmenter la puissance jusqu'à ce que l'augmentation du nombre de photons semble diminuer de manière significative. Par rapport au graphique d'augmentation de la puissance, tracez le logarithme du nombre de photons en fonction du logarithme de la puissance. Toute déviation par rapport à une pente de deux indique un blanchiment.

Pendant la surveillance, sélectionnez une puissance de moniteur raisonnable inférieure à cette valeur limite. Déterminons maintenant les paramètres d'entrée du compteur multicanaux et du générateur d'impulsions. Sur le générateur d'impulsions.

Réglez le temps de pré-illumination à une valeur comprise entre une et deux fois plus grande que le temps de demi-recouvrement attendu, et le temps de photoblanchiment à environ un dixième du temps de demi-recouvrement attendu sur le module de réglage. Réglez la largeur des classes à environ la moitié de la durée de photoblanchiment, puis fixez le nombre de classes par enregistrement de sorte que le produit de la largeur de classe choisie par le nombre de classes par enregistrement soit supérieur au temps de recouvrement complet attendu. Ajoutez les durées de pré-illumination et de photoblanchiment, puis saisissez cette valeur dans le générateur d'impulsions, et réglez la fréquence de la séquence de pré-illumination et de photoblanchiment à une valeur légèrement inférieure à l'inverse du produit de la largeur de classe par le nombre de classes par enregistrement.

Enfin, réglez le nombre d'enregistrements par balayage sur le compteur en fonction de l'intensité du signal à la puissance de surveillance choisie. Réglez ensuite la puissance de surveillance à un niveau sûr et la puissance de blanchiment à environ 200 milliwatts au-dessus du seuil de blanchiment déterminé lors du test de blanchiment de surveillance. Ces puissances sont toutes deux définies par des tensions différentes appliquées au cristal scellé de la cellule AL, puis éteignez les lumières du microscope.

Activez le PMT. Lancez une analyse ponctuelle sur le logiciel d'imagerie. Ensuite, démarrez le générateur d'impulsions et le compteur.

Pour analyser la courbe de récupération obtenue, marquez trois points importants : la fluorescence avant la photodétruction, la fluorescence immédiatement après la photodétruction et la fluorescence à la fin du jeu de données. Utilisez les valeurs de fluorescence avant et immédiatement après la photodétruction afin d'estimer plus précisément le temps de demi-récupération.

Maintenant, utilisez les règles décrites dans les étapes précédentes pour mettre à jour les valeurs des durées de pré-éclaircissement et de largeur d'impulsion. Enregistrez une nouvelle courbe et continuez à ajuster les paramètres jusqu'à ce que la courbe résultante présente un fort éclaircissement et une récupération lisse. Vérifiez la saturation d'excitation en traçant le logarithme du paramètre de profondeur d'éclaircissement en fonction du logarithme de la puissance.

Toute déviation par rapport à une pente de deux indique une saturation de l'excitation. Choisissez une puissance de blanchiment qui produit un fort blanchiment mais n'entraîne pas de saturation. Enfin, une fois les paramètres appropriés déterminés, continuez à enregistrer les courbes de récupération de fluorescence multiphotonique après photoblanchiment ou courbes MP FP de votre échantillon d'intérêt.

Nous allons maintenant présenter des résultats représentatifs des données brutes de FRAP de MP, ainsi qu'une courbe normalisée de MP F wrapp ajustée à l'aide d'un modèle, le coefficient de diffusion. Les données brutes de FRAP de MP montrent une forte photodétruction et une récupération lisse. La récupération complète étant rapportée pour la seconde moitié des données afin d'ajuster celles-ci. Nous normalisons d'abord la récupération par rapport à la fluorescence moyenne avant photodétruction, puis nous effectuons un ajustement par la méthode des moindres carrés non linéaire.

En ce qui concerne le modèle approprié, les deux jeux de données ont été obtenus en présence de fluorescéine aqueuse et donnent des coefficients de diffusion conformes à la littérature. Nous venons de vous montrer comment réaliser une expérience de récupération de fluorescence après photobléachage à plusieurs photons.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention et de définir vos paramètres expérimentaux, en particulier la durée de la photodestruction ainsi que les puissances de photodestruction et de suivi, en les maintenant dans les limites de sécurité établies dans le protocole. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.