Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

Ici, nous observons la procédure de collecte des embryons. Transférez les mouches des flacons vers les tubes d'une chambre de collecte à cinq canaux. Ensuite, placez une plaque d'agar aux raisins sur le dessus de la chambre et laissez les mouches pondre des œufs pendant quelques heures.

Lorsque les embryons sont au stade approprié, les transférer du disque de raisin au ruban adhésif double face à l’aide d’un pinceau. Ensuite, retirer délicatement les embryons de leurs chorions et les aligner sur un bloc d’agar, côté ventral vers le haut. Au centre, on voit une lame porteuse munie d’un rectangle de cire et d’un morceau de ruban adhésif double face à une extrémité. Retourner délicatement le ruban adhésif double face au-dessus du bloc contenant les embryons alignés, puis le poser légèrement sur les embryons afin de les transférer sur la lame.

Ils seront désormais immédiatement du côté dorsal vers le haut. Ajouter du PBS dans la zone de la lame délimitée par le rectangle de cire afin de recouvrir les embryons. L'image du haut montre une vue latérale de la lame et celle du bas montre une vue de dessus.

Coupez une fente le long de la membrane veilleuse à l’aide d’une aiguille de dissection en verre. Percez les embryons dans la région cérébrale, soulevez-les et disposez-les en rangées sur le verre. Ensuite, disséquez chaque embryon pour obtenir un filet.

À la fin de la procédure, vous disposerez d'une lame avec des rangées d'embryons de filet. Elle est désormais prête à être fixée. Bonjour, je suis Peter Lee, chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Kaizens, à la division de biologie du Caltech.

Bonjour, je suis Ashley Wright, étudiante diplômante au Caltech dans le laboratoire de Kaizen. Je suis Kaizen, professeur au Caltech, et mon équipe de recherche étudie le développement du système nerveux chez la drosophile. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour disséquer des embryons de drosophile vivants.

Nous avons utilisé ces méthodes pour rechercher des ligands de récepteurs orphelins. Pour ce faire, nous criblons des collections de lignées surexprimant des protéines de surface cellulaire par marquage sur embryons vivants à l’aide de protéines de fusion réceptrices. Nous utilisons également cette procédure au laboratoire pour étudier les phénotypes embryonnaires et réaliser des cribles génétiques.

J'ai réalisé un écran de déficience pour les actes moteurs sur les phénotypes de guidage. Commençons donc. Peter va vous montrer comment procéder.

Pour commencer, utilisez une spatule pour déposer une goutte de pâte de levure sur une plaque de collecte d'œufs sur milieu à base de raisin correspondant à chacun des fûts d'une chambre de collecte d'embryons. Ensuite, injectez du gaz dioxyde de carbone dans les flacons à mouches afin d'endormir les mouches. Transférez quelques centaines de mouches directement dans la chambre de collecte.

Ensuite, couvrez la chambre avec la plaque de collecte des œufs et appuyez fermement. À l'aide d'une bande de ruban adhésif de 20 pouces de long, fixez ensemble la chambre et la plaque en commençant par le milieu de la boîte d'agar. Le ruban chevauchera la plaque de collecte des œufs. Une fois que les mouches se sont réveillées, incubez-les à température ambiante à l'abri de la lumière pendant deux ou trois heures en position horizontale. Après l'incubation, tapez doucement pour faire descendre les mouches, puis remplacez la plaque de collecte.

Si moins de 100 embryons sont présents sur chaque secteur de la plaque retirée, poursuivez des collectes de deux heures jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'embryons ait été réuni. Les embryons collectés peuvent être regroupés selon les spécifications indiquées dans le protocole écrit accompagnant.

Pour vieillir les embryons, placez un morceau humide de papier filtre circulaire de 90 millimètres dans le couvercle d'une boîte de Pétri et posez la plaque de collecte avec les embryons à l'envers dessus. Incubez la plaque pendant la durée souhaitée et à la température désirée, puis préparez une lame pour le classement et le tri des embryons en plaçant un ruban adhésif double face sur une lame. Ensuite, placez un bloc rectangulaire d'agar aux raisins sur la lame S.

L’embryonnateur doit être assez grand pour contenir cinq à dix rangées de 10 à 15 embryons. Une fois que les embryons ont atteint le stade souhaité, retirez-les de l’incubateur. Transférez les embryons âgés depuis la plaque de collecte vers le ruban adhésif double face.

À l’aide d’un pinceau humide, répartir uniformément les embryons sur le ruban. Sous un microscope stéréoscopique à fluorescence GFP, sélectionner les embryons présentant une expression adéquate de GFP, qui indique le génotype. Dans cette expérience, le génotypage est réalisé en sélectionnant les embryons qui ne présentent pas d’expression du marqueur GFP porté par le chromosome équilibreur portant la mutation « curly arm ».

Étant donné que le génotypage des embryons variera selon l'équilibreur utilisé, veuillez consulter le protocole écrit joint pour obtenir plus d'informations sur la réalisation de cette étape. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection émoussée, faites adhérer les embryons en les roulant délicatement sur du ruban adhésif double face.

À ce stade, l'intestin commence à développer des bandes obliques près de la queue, puis s'enroule, et l'embryon devient plus net. Ensuite, utilisez l'aiguille de dissection pour faire rouler chaque embryon au-dessus du chorion ou d'autres embryons. En évitant tout contact avec le ruban adhésif, soulevez l'embryon et transférez-le sur le bloc d'agar aux raisins.

Alignez les embryons enrobés sur cette lame avec leur face dorsale contre la lame d'agar et leurs extrémités postérieures orientées vers le bas. Ensuite, placez la lame dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide et incubez les embryons à température ambiante jusqu'à ce qu'ils atteignent l'âge souhaité. Pour la dissection, préparez une lame destinée à la dissection vivante en découpant un petit morceau rectangulaire de ruban adhésif double face. Placez le ruban près d'une extrémité d'une lame super frost plus à l'aide d'un crayon à cire.

Dessinez un rectangle ayant la largeur de la lame et mesurant de 30 à 40 millimètres de long autour du ruban adhésif. Il doit y avoir environ trois millimètres d'espace entre la cire et le ruban. Ensuite, transférez les embryons depuis la boîte de Pétri sur le ruban en retournant la lame et en l'abaissant délicatement sur les embryons alignés, de sorte que le ruban entre en contact avec ceux-ci.

Les embryons doivent être orientés avec les extrémités postérieures vers le bas. Après le transfert, positionnez les embryons avec le côté dorsal vers le haut sur la lame, puis ajoutez immédiatement un XPBS au-dessus des embryons pour remplir le rectangle de cire à l’aide d’une aiguille de dissection en verre, fabriquée sur un tire- aiguilles comme une aiguille d’injection. Incisez le long de la ligne médiane dorsale en partant de l’extrémité postérieure de l’embryon.

Maintenant, piquez l'extrémité antérieure de l'embryon et soulevez-la. En partant du bas, transférez l'embryon à droite de la bande adhésive, en le maintenant dans le tampon. Poursuivez la dissection et le transfert des embryons, en formant une rangée ordonnée d'embryons sur la lame qui correspond à chaque rangée du bloc agar.

À l’aide de l’aiguille de dissection, abaissez délicatement les lamelles de la paroi corporelle sur la lame. Veillez à ne pas étirer ni enlever de matière de leur surface. L’aiguille ne doit entrer en contact qu’avec les coins antérieur et postérieur aux bords dorsaux de la paroi corporelle.

Étant donné que les axones moteurs ne s'étendent pas aussi loin dorsalement, évitez de toucher les aiguilles de la lame, car elles se briseraient après que tous les embryons aient été transférés et fixés sur la lame. Retirez l'intestin de chaque embryon en sectionnant les quatre intestins de la région cérébrale et en tirant l'intestin entier loin de l'embryon.

Déplacer l'intestin postérieur sur la lame. Une fois toutes les dissections terminées, utilisez deux pipettes Pasteur pour ajouter simultanément, dans un coin du rectangle de cire, du formaldéhyde à 5 % à température ambiante, tout en retirant la solution du coin opposé. Renouvelez le fixateur trois fois en utilisant un volume total d'environ six millilitres.

Incuber les embryons dans la solution de fixation pendant 45 minutes. Il est très important de ne pas laisser le ménisque entrer en contact avec les embryons, car cela les détruirait. Utilisez une pipette Pasteur pour éliminer la majeure partie de la solution de fixation.

Lavez avec du PBS 3 fois en utilisant la méthode des pipettes Pasteur. Ensuite, lavez trois fois avec du PBT pour rendre les embryons perméables. Cette étape rend également les embryons moins sensibles au ménisque.

Après le dernier lavage, retirez soigneusement le PBT en inclinant la lame et en effleurant brièvement un coin de la zone délimitée par la cire avec une serviette Kim pour éliminer la solution excédentaire. À l’aide d’une pipette préchargée, ajoutez immédiatement 200 microlitres de solution de blocage pendant 10 à 30 minutes. À température ambiante, retirez la solution de blocage à l’aide d’une serviette Kim.

Ensuite, ajoutez immédiatement 200 microlitres d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. Placez la lame dans une boîte humide et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Dans cette expérience, l'anticorps monoclonal 1D four est utilisé pour marquer les axones moteurs.

Le lendemain, retirez les boîtes de quatre degrés Celsius et lavez les embryons trois fois sur une plateforme agitée avec du PBT pendant au moins 15 minutes par lavage. Pour toutes les étapes de lavage, assurez-vous qu'il y a suffisamment de PBT pour immerger complètement la lame pendant l'agitation. Après avoir lavé les embryons, bloquez la lame comme précédemment.

Après le blocage, ajoutez immédiatement 200 microlitres d'anticorps secondaire dans la solution de blocage et incubez pendant deux heures à température ambiante ; ici, un secondaire Alexa 488 chèvre anti-US est utilisé en conjonction avec la phallotoxine marquée à la rhodamine pour marquer les fibres musculaires. Lavez à nouveau trois fois avec du PBT sur la plateforme agitée, pendant au moins 15 minutes par lavage.

Transférez les lames vers un autre bac pour éliminer le détergent résiduel. Rincez ensuite deux fois avec du PBS pendant cinq minutes. Retirez la lame du bac PBS, éliminez la majeure partie du PBS restant dans le puits à l’aide d’un essuie-tout chimique et ajoutez immédiatement 500 microlitres de glycérol à 70 %.

Étant donné que le glycérol a le même indice de réfraction que l'embryon, réaliser cette étape rendra la coloration plus visible. Clarifiez les embryons pendant deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le glycérol à l'aide d'un essuie-tout. L'élimination de presque tout le glycérol aplatira les embryons, tandis qu'une quantité moindre de glycérol retirée donnera une structure plus tridimensionnelle.

Une fois que le glycérol a été éliminé, placez une lame de couverture numéro un. Les embryons sont prêts pour l'imagerie ; les embryons disséqués et colorés peuvent être visualisés par microscopie en immunofluorescence. Ici, un embryon disséqué a été marqué avec l'anticorps de marquage des axones moteurs 1D quatre.

Cette image est similaire, en apparence, aux images plus couramment observées dans lesquelles la chimie immunohistochimique à la peroxydase (HRP) a été utilisée pour la visualisation par immunofluorescence. Il est possible d'obtenir des images de meilleure qualité dans lesquelles les détails des branches des axones moteurs sont visibles plus clairement. La coloration double avec la phalloïdine marquée au rhodamine, qui se fixe à l'actine, permet la visualisation simultanée des muscles.

Cela donne une image plus claire du lamellage et de l'organisation musculaire que ce qui peut être obtenu par la coloration au HRP. Ici, les axones moteurs 1D four ou Fein sont représentés en vert, tandis que le muscle est montré en rouge. Nous venons de démontrer comment disséquer des embryons vivants de drosophile à partir de lignées mutantes. Lorsque vous effectuez ces protocoles, il est important de commencer par des lignées simples comme lio, armadillo, GFP, ou des souches équilibrées, et de n'en traiter que quelques-unes à la fois.

À mesure que vous gagnerez en expertise et en rapidité dans les dissections, vous pourrez réaliser jusqu'à 10 lignées par jour, ce qui vous permettra d'analyser une collection d'environ 200 lignées mutantes en une vingtaine de jours. Cette procédure est donc très efficace une fois que vous maîtrisez toutes les étapes. Voilà, merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.