Visualisation de localisation de l'ARN Xenopus Les ovocytes

Dans cette procédure, l'ARN marqué par fluorescence. Les transcrits sont injectés dans des cytes XUS et leur localisation est surveillée. Premièrement, l'ARN est marqué avec des nucléotides fluorescents.

Dans une réaction de transcription in vitro, l'ARN est ensuite chargé dans un appareil de microinjection. Les ovocytes sont placés dans une boîte de microinjection et soigneusement microinjectés. Enfin, les ovocytes sont mis en culture pour permettre la localisation de l'ARN avant leur observation au microscope confocal.

Bonjour, je suis James Gagnan du laboratoire de la Dre Kimberly Mallory au Département de biologie moléculaire, biologie cellulaire et biochimie de l'Université Brown. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de visualiser la localisation subcellulaire des ARN dans les ovocytes de Xap. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'architecture des ARN et les facteurs protéiques nécessaires à la localisation des ARN durant le développement précoce des vertébrés.

Commençons donc. Pour commencer cette procédure, transcrivez l'ARNm, qui est marqué de manière radioactive et fluorescente comme décrit dans le protocole écrit associé. Ajoutez du DS pour dégrader l'ADN matrice, puis arrêtez la réaction en ajoutant de l'EDTA.

Éliminer les nucléotides non incorporés et autres petites molécules en faisant passer l'échantillon à travers une colonne G 50 par centrifugation. L'ARN est ensuite concentré par précipitation à l'éthanol, lavé et resuspendu. Après avoir déterminé la concentration par comptage scintillométrique, diluer l'ARN à 50 nano molaire et le conserver en aliquots de cinq microlitres à moins 80 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt à effectuer la microinjection, décongelez un éloqua d'ARN marqué et dénaturez-le à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez pendant 10 minutes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante afin d'éliminer les particules, puis maintenez sur glace. Par la suite, isolez les cytes en découpant des fragments de xap post lavu d'ovaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres d'une solution à 3 milligrammes par millilitre.

Collagénase dans un tampon phosphate de potassium 0,1 molaire à pH 7,4. Agiter doucement à 18 degrés Celsius en raison de variations entre lots. La durée du traitement à la collagénase peut varier et doit être surveillée attentivement par inspection visuelle.

Pour assurer la défollification, continuer d'agiter pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les ovocytes soient visiblement séparés de l'ovaire, puis laisser les ovocytes se déposer au fond du tube conique. Éliminer la solution et la remplacer par du tampon MBSH. Répéter cette opération, effectuer deux autres lavages pour un total de trois lavages.

Ensuite, triez manuellement les cytes de stade trois à quatre dans du tampon MBSH sous un microscope optique standard. Les cytes de stade trois sont complètement opaques, mais blancs. Les cytes de stade quatre sont légèrement plus grands et parsemés de pigments.

Les cellules légèrement transparentes sont trop jeunes, tandis que celles qui sont complètement pigmentées ou présentent une distribution polarisée du pigment sont trop âgées. Enfin, préparez les aiguilles pour la microinjection en utilisant des capillaires de trois pouces et demi, étirez-les et affûtez-les afin d'obtenir des aiguilles dont le diamètre extérieur est d'environ 0,05 millimètre. Maintenant que les ovocytes ARNm et les aiguilles sont prêts, passez à la microinjection.

Commencez par étalonner l'aiguille avec de l'eau désionisée afin de délivrer deux nanomètres par injection. Chargez l'aiguille à l'aide d'un micro-injecteur contrôlé par gaz et étalonnez la taille des gouttes à l'aide d'un micromètre. Après l'étalonnage, chargez par l'avant l'ARN à injecter dans l'aiguille. Ensuite, placez les ovocytes triés dans une boîte de microinjection contenant du tampon MBSH, la boîte comportant une couche de mousse de caoutchouc noire.

Les cytes blancs se distinguent bien sur un fond noir. Injectez ensuite soigneusement chaque ovocyte avec deux litres d'ARN à 50 nanomolaire. Veillez à n'injecter chaque ovocyte qu'une seule fois et vérifiez régulièrement l'aiguille pour détecter tout colmatage une fois l'injection terminée.

Expulsez l'ARN restant, rincez l'aiguille avec de l'eau désionisée et chargez l'ARN suivant pour l'injection. Après l'injection, transférez les cytes injectés dans une cavité d'une plaque stérile de 24 puits, jusqu'à mille. Les CYTES peuvent être cultivés par cavité.

Retirez le tampon et remplacez-le par 400 microlitres de milieu de culture cellulaire par puits. Ensuite, placez la plaque de culture dans un récipient en plastique contenant une serviette en papier humide afin de maintenir un environnement humide pendant la culture, et incubez les ovocytes à 18 degrés Celsius pendant des durées variant entre huit et 48 heures après la période d'incubation souhaitée. Les ovocytes peuvent être préparés pour la microscopie après incubation des ovocytes injectés.

Éliminer les ovocytes morts et placer les ovocytes survivants dans des vials en verre. Un taux de survie supérieur à 90 % des ovocytes est habituellement observé. Remplacer le tampon par le fixateur M-E-M-F-A et agiter doucement les cytes pendant 20 minutes.

Protéger les ovocytes de la lumière du soleil pendant la fixation une fois la période de fixation terminée. Laver les ovocytes en éliminant le fixateur et en le remplaçant par un volume équivalent de tampon MBSH. Répéter ce lavage une fois supplémentaire pour un total de deux lavages.

Ensuite, lavez les ovocytes dans du méthanol anhydre. Commencez par retirer la moitié du volume et remplacez-le par du méthanol. Répétez cette opération deux fois supplémentaires.

Après ces lavages, éliminer toute la solution et la remplacer par du méthanol. Répéter ce lavage au méthanol une fois supplémentaire. Les ovocytes fixés et déshydratés peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu'au moment de l'imagerie.

Avant l'imagerie, ajoutez le milieu de clarification de Marie à une boîte fluoro WPI à fond en verre afin de recouvrir la surface d'imagerie. Transférez soigneusement les ovocytes du méthanol vers la boîte fluoro, en minimisant le volume de méthanol transféré. Imagez les ovocytes sur un microscope confocal inversé ; un Zeiss LSM five 10 et un aica TCSs P donnent de bons résultats. Nous allons maintenant montrer quelques images représentatives de la localisation sous-cellulaire des ARN juste après la microinjection : l'ARN marqué au fluorophore peut être observé dans le noyau après huit heures de culture d'un témoin marqué au fluorophore.

On observe que l'ARN est uniformément distribué dans le cytoplasme de l'ovocyte. Toutefois, un ARN marqué par fluorescence et contenant des séquences capables de recruter le système de transport peut être vu en cours de localisation subcellulaire vers le pôle végétatif de l'ovocyte. Nous venons de vous montrer comment micro-injecter des ARN marqués par fluorescence dans des ovocytes et observer la localisation de l'ARN par microscopie confocale.

Lors de cette procédure, il est important d'utiliser des solutions traitées au diéthylpyrocarbonate (DEPC) afin d'éviter toute contamination par les ARN en culture, de maintenir vos cellules dans un milieu OCM contenant des antibiotiques et de protéger vos cellules de la lumière du soleil autant que possible afin d'éviter le photoblanchiment. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.