Robotique et d'analyse d'images dynamiques pour les études d'expression génique dans les tissus végétaux

Dans cette procédure, la dynamique de l'expression génique dans les tissus végétaux est visualisée au fil du temps à l'aide de la robotique. Tout d'abord, des graines de haricot lima sont stérilisées puis placées entre des essuie-tout humidifiés dans un récipient de culture tissulaire afin de favoriser la germination. Après quatre jours, les cotylédons sont prélevés et bombardés avec un construit d'ADN contenant un promoteur fusionné à la GFP. Les cotylédons placés dans des boîtes de Petri sont montés sur un système robotisé personnalisé de collecte d'images en deux dimensions. Le robot est programmé pour acquérir une image de chaque fragment de tissu toutes les heures pendant 100 heures.

Les images sont soumises à une analyse d'image, fournissant des données quantitatives sur l'intensité de l'expression de la GFP au fil du temps. Bonjour, je suis John Finer, directeur du laboratoire de transformation végétale du département d'horticulture et de sciences des cultures à l'université d'État de l'Ohio. Je suis Carlos Herandez Garcia, étudiant au doctorat dans le laboratoire Finer à l'université d'État de l'Ohio.

Aujourd'hui, Carlos va vous montrer le protocole que nous avons mis au point pour l'analyse de l'expression génique et des tissus végétaux à l'aide de la protéine fluorescente verte. Nous utilisons cette procédure, que nous avons développée en laboratoire, pour mesurer l'activité de la souche OD. Pour ce faire, nous plaçons d'abord notre promoteur en amont du gène GFP, qui est notre gène rapporteur.

Je vais vous montrer comment nous introduisons la régulation par promoteur dans la veine de Lima Cataly et envoyons une application sur notre système robotisé personnalisé de capture d'images. J'achèverai en passant en revue notre protocole d'analyse d'images. Commençons donc par stériliser la surface des graines de haricot de Lima selon des procédures standard.

Placer les graines stérilisées dans des récipients Magenta GA7 entre des couches de papier absorbant humide et les incuber pendant quatre jours à 25 degrés Celsius. Ici, nous utilisons un vecteur d'expression à nombre élevé de copies, utile pour les analyses de promoteur et d'éléments promoteurs. Ce vecteur contient le gène GFP, utilisé pour visualiser l'activité du promoteur ou des éléments promoteurs dans les tissus transformés environ une à deux heures avant le bombardement.

Excisez les embryons de haricot lima CU à partir des testas. Les embryons CU appropriés pour le bombardement doivent être jaunes à vert clair, plats et sans aucun dommage pouvant interférer avec l'analyse d'image ultérieure. Immédiatement après l'excision, placez 12 embryons CU dans une boîte de Pétri contenant le milieu de culture OMS composé de sels MS, de cinq vitamines, de 3 % de saccharose et de 0,2 % de gélatine, à un pH de 5,7. Ensuite, précipitez la construction d'ADN sur des particules de tungstène M 10. Juste avant utilisation, remettez en suspension les particules dans de l'eau stérile à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Ensuite, dans un tube de 0,6 millilitre, ajouter 25 microlitres de particules, 5 microlitres d'ADN à une concentration de 1 microgramme par microlitre, 25 microlitres de chlorure de calcium 2,5 molaire et 10 microlitres de spermine 100 millimolaire. Incuber la préparation d'ADN sur de la glace pendant cinq minutes, puis prélever et jeter 50 microlitres de la solution située au-dessus des particules. Remettre en suspension les particules recouvertes d'ADN restant au fond du tube par vortexage.

Et immédiatement après avoir vortexé, prélevez deux microlitres d'Eloqua. Répétez cette étape de vortexage. À chaque fois qu'un prélèvement d'Eloqua est effectué, les particules revêtues doivent être maintenues sur glace et utilisées dans les 15 minutes.

À présent que l'ADN est fixé sur les particules, déposez deux microlitres de particules à travers le haut d'un filtre à seringue placé au centre d'un tamis filtrant. Ensuite, insérez le filtre à seringue dans le support de filtre situé à l'intérieur de la chambre du pistolet d'injection de particules, ou chambre PIG. Placez un haricot lima avec le côté axial vers le haut sur une plaque déflectrice constituée d'un tamis soudé au fond d'un bécher.

Placer la plaque déflectrice, utilisée comme plateforme de support des tissus pendant le bombardement dans la chambre du canon à particules. Pour bombarder le tissu, ouvrez d'abord la vanne menant au vide afin d'évacuer la chambre. Lorsque le vide atteint 760 millimètres de mercure, activez l'électrovanne et libérez l'hélium pour propulser les particules.

La pression d'hélium utilisée pour accélérer les particules est comprise entre 50 et 60 psi. Après le bombardement de particules, fermez la vanne de la ligne de vide et relâchez le vide à l'aide de la vanne d'échappement. Une fois le vide relâché, ouvrez la porte de la chambre pour récupérer le co leadin bombardé et remettez le co leadin du côté dal.

Jusqu'au milieu de culture OMS pour la quantification et le profilage d'expression. Bombarder un minimum de trois co-pilotes pour chaque construction d'ADN. Un témoin positif, fournissant un profil d'expression génique bien étudié, est également inclus.

Les préparations sont désormais prêtes à être observées en microscopie. Allumez la lampe au mercure et attendez 30 minutes pour permettre à la lampe de se réchauffer. Allumez les sources d'alimentation pour la caméra SPOT R-T-C-C-D et le contrôleur de moteur, qui commande les déplacements de la plateforme robotique sur mesure, supportant huit plaques.

Régler le jeu de filtres pour la détection de la GFP en sélectionnant le jeu de deux filtres pour la GFP à une excitation de 480 nanomètres et une émission de 510 nanomètres sur un microscope stéréoscopique MZ L trois. Ensuite, stériliser les couvercles épaissis en polycarbonate des boîtes de Pétri en les pulvérisant avec de l'éthanol à 70 %. Les couvercles spécialisés utilisés pour recouvrir la base de la boîte de Pétri empêchent la condensation pendant la collecte des images.

Placer les plaques contenant le cuan bombardé sur la plateforme robotique et serrer la vis de blocage latérale pour les fixer en position. Ouvrir maintenant l'application logicielle personnalisée qui contrôle à la fois la plateforme robotique et l'acquisition d'images. Ouvrir également le commutateur logiciel du contrôleur de lumière blanche à l'aide du logiciel, puis orienter la plateforme vers la position initiale.

Cela est effectué avant de saisir les positions. Pour chaque entrée coddle dans l'onglet moteur, sélectionnez la première plaque. La plateforme positionnera le centre de la boîte de Pétri sous l'objectif du microscope.

À l'aide des boutons de déplacement, positionnez précisément le premier CU LEADIN pour la collecte d'images. En utilisant la fonction mode direct, déplacez le cuddle leaden vers la zone d'observation appropriée. Pour le premier cuddle leaden, utilisez les molettes manuelles du microscope stéréoscopique pour régler la mise au point et fixez le grossissement à 1,6 x. Une fois la région d'intérêt définie, cliquez sur le bouton ajouter cette position.

Le logiciel ajoutera les coordonnées de cette région à un fichier de plan de positionnement, et la plateforme reviendra au centre des positions définies sur la plaque pour tous les coens restants. À l’aide des boutons de distance de déplacement, utilisez les trois vis de réglage manuel situées sous chaque plaque sur la plateforme robotique afin d’ajuster la mise au point pour les coans restants sur la même plaque. Une fois que toutes les coordonnées de chaque coan ont été saisies, enregistrez les coordonnées du plan de positionnement.

Entrez les paramètres de collecte des images, tels que le type de lumière, qui est bleue pour la GFP, et le réglage d'exposition, ainsi que le répertoire de stockage des images, comme décrit dans le protocole écrit associé. Accédez à l'onglet de contrôle du temps de capture et définissez l'intervalle de temps d'acquisition des images ainsi que le nombre total de cycles de collecte. Les images sont généralement collectées toutes les heures pendant 100 heures.

Génération de profils d'expression génique bien définis. Commencez l'acquisition d'images en ouvrant l'onglet du planning des positions, puis en cliquant sur le bouton de lancement du planning. Isolez le système de collecte d'images de toute lumière parasite à la fin de la période de collecte d'images de 100 heures.

Les images haute résolution, d'une taille d'environ cinq mégaoctets chacune, sont prêtes pour l'analyse d'image. Utilisez Image Ready pour assembler les 100 images séquentielles provenant de chaque dossier. Importez toutes les images séquentielles en tant que trames et redimensionnez-les à 800 par 600 pixels afin d'accélérer le traitement des images.

Ensuite, utilisez les repères sur un nouveau calque introduit, visible sur toutes les images, en vous appuyant sur les points GFP sélectionnés dans l'image de référence. Ajustez manuellement chaque image ; une fois l'alignement terminé, supprimez le calque utilisé comme référence et enregistrez le fichier sous forme d'un fichier PSD unique. Exportez également toutes les images sous forme d'un fichier MOV unique en utilisant la résolution la plus élevée possible.

Les fichiers sont désormais prêts pour commencer la quantification de la GFP. Utilisez ImageJ pour ouvrir le fichier MOV et recadrez une zone de 400 par 300 pixels. Ensuite, séparez les images séquentielles en canaux rouge, bleu et vert à l’aide de l’outil de séparation RVB pour les canaux rouge et vert.

Soustrayez la fluorescence de fond à l’aide de l’outil de greffon « soustraire la ROI mesurée pour chaque coupe ». Calculez l’expression de la GFP en ajustant les niveaux de seuil et en utilisant un greffon conçu pour mesurer la valeur moyenne de la gamme de gris par pixel ainsi que le nombre total de pixels exprimant la GFP. Copiez les valeurs obtenues dans ImageJ. Enfin, collez les valeurs obtenues pour les canaux vert et rouge dans Microsoft Office.

Excel pour une manipulation ultérieure des données afin de vous donner une idée des résultats de l'alignement d'images. Cette première animation montre l'imprécision du repositionnement de la plateforme robotique au cours de l'expérience de 100 heures. Le déplacement des taches est un artefact résultant de l'incapacité de la plateforme robotique à revenir exactement à la même position à chaque point temporel après un alignement manuel des images ; les cellules exprimant la GFP peuvent être facilement observées, et les caractéristiques uniques de ce système de suivi sont clairement visibles.

Lorsque vous observez la répétition de cette animation, notez les cellules exprimant la GFP qui sont encerclées : la cellule entourée en rouge montre une diminution très rapide de l'expression entre 18 et 20 heures après le bombardement, tandis que la cellule encerclée en blanc présente un début différé de l'expression de la GFP. Outre les animations, cette procédure permet une quantification rapide de l'expression de la GFP dans le temps au sein du tissu cible de haricot lima. Ces résultats représentatifs illustrent la quantification comparative de l'intensité des promoteurs à l'aide du promoteur CAMV 35 S et de quatre promoteurs différents de soja.

Nous venons de vous montrer comment introduire de l'ADN dans le catalin de germinate. Les graines de Lima vein placent le catalin sur le robot, capturent des images pour l'analyse d'image et analysent ces images. Nous utilisons couramment cette procédure dans notre laboratoire pour valider les promoteurs végétaux de clone.

On peut générer une grande quantité de données à partir de l'introduction de différents promoteurs végétaux. Toutefois, cette procédure est complexe et comporte de nombreuses étapes pouvant présenter des erreurs. Il est important de commencer avec des graines fraîches de haricot ou, à tout le moins, d'utiliser des graines de haute qualité ayant été correctement conservées. Il est également essentiel de placer rapidement le couvercle découpé pour le bombardement et de le configurer sur le robot, ainsi que d'utiliser le couvercle épais de la boîte de Pétri afin de minimiser les problèmes de condensation.

Et enfin, veuillez noter que la GFP que nous utilisons est une autre version appelée SGFP, provenant du Gen HIN Lab de l'Université Harvard. Cette GFP n'est pas très stable et pourrait être plus adaptée pour suivre les changements rapides de l'expression génique. Et voilà pour notre présentation.

Bonne chance avec vos expériences.