Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

Ce vidéo montre une procédure permettant de stimuler et de colorer des cellules mononucléées du sang périphérique ou pbmc. Pour une analyse en cytométrie en flux multicolore, Alec Watts de pbmc isolées à partir de sang total sont placées dans des plaques de culture tissulaire. Les cellules sont stimulées chimiquement ou biologiquement afin de produire une réponse immunitaire.

Après la stimulation, un cocktail d'anticorps est ajouté afin d'identifier les types cellulaires selon les marqueurs membranaires exprimés. Les cellules sont ensuite perméabilisées et un autre cocktail d'anticorps est ajouté pour détecter l'expression de cytokines intracellulaires ; les cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux pour déterminer les profils de cytokines de sous-populations spécifiques de PBMC. Bonjour, je suis Amy Courtney du laboratoire du Dr. Jagan SAS, du Département d'Immunologie à l'Université du Texas, Centre du Cancer MD Anderson.

Bonjour, je suis Hong, également du laboratoire. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une analyse de cytométrie multiparamétrique des réponses des lymphocytes T. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses immunitaires cellulaires chez le Macaca mulatta.

Commençons. Commencez ce protocole en utilisant un hémocytomètre pour déterminer les concentrations cellulaires viables de pbmc provenant de Reuss Maca par la méthode d'exclusion du colorant Bleu de Trypan. Travaillez dans une hotte à flux laminaire reus.

Suspendre les cellules dans du milieu complet à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre pour une stimulation non spécifique, en ajoutant 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits. Ajouter ensuite 100 microlitres de milieu contenant du PMA et du CIN afin d'obtenir un volume total de 0,2 millilitre, avec une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre de PMA et de 500 nanogrammes par millilitre de CIN ; pour les puits de contrôle négatif, ajouter 100 microlitres de milieu complet seul à chacun. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone après 1,5 heure.

Ajouter de la feldénine A à la culture à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incuber pendant 4,5 heures supplémentaires. La feldénine A est ajoutée pour piéger les cytokines dans l'appareil en or G afin d'améliorer la visibilité par immunomarquage. Après la stimulation, centrifuger pour éliminer le milieu, puis laver en ajoutant 200 microlitres de tampon de lavage fluide froid et centrifuger à faible vitesse. Répéter ce lavage, puis resuspendre dans 50 microlitres de tampon de lavage fluide.

Les cellules sont désormais prêtes à être marquées pour l'expression de marqueurs membranaires dans chaque puits des cellules remises en suspension. Ajouter un microlitre de colorant fluorescent fixable aqua vivant-mort, préparé conformément aux instructions du fabricant et de S. Incuber à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 30 minutes, pendant que les cellules sont en incubation.

Préparez les solutions de marquage qui seront utilisées pour les faits dans des tubes micro. Préparez d'abord un cocktail de référence à inclure de manière appropriée. Anticorps monoclonaux marqués par fluorescence titrés, anti CD trois PE SCI sept, anti CD huit Alexa 700, anti CD 28 per CCP SCI 5,5, anti CD 95 A PC et anti CD quatre Pacific Blue dans le tampon de lavage Inflow.

Ensuite, préparez les témoins de compensation, qui serviront à déterminer les coefficients de recouvrement de chaque coloration individuelle dans les autres détecteurs, en préparant un tube pour chaque anticorps marqué individuellement, comme coloration monocromatique. Enfin, préparez les colorations fluorescence moins un (FMO) en combinant tous les réactifs sauf celui d'intérêt. Ces témoins permettront de définir la limite entre une population positive et négative en reproduisant les niveaux d'autofluorescence et les données présents dans les échantillons entièrement colorés.

Après avoir incubé les cellules dans le colorant vivant-mort, lavez-les une fois avec du tampon de lavage froid pour flux afin d'éliminer l'excès de colorant, puis aspirez le tampon de lavage. Ajoutez ensuite les solutions de coloration préparées. Incubez les cellules à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière, pendant 30 minutes.

Lavez les cellules marquées avec du tampon de lavage froid pour éliminer l'excès d'anticorps. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation BD pendant au moins 10 minutes. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à 24 heures avant utilisation, ou poursuivez directement le marquage des cytokines intracellulaires.

Perméabilisez d'abord les cellules dans 100 microlitres de perméabilisant 1X. Incubez avec le tampon de lavage pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius à l'obscurité, pendant que les cellules s'incubent. Préparez les anticorps de marquage, les contrôles de compensation et les contrôles FMO dans du tampon de lavage 1X comme précédemment.

Après avoir incubé les cellules pendant 10 minutes, centrifuger et éliminer le tampon de perméabilisation 1 x. Ajouter les anticorps de marquage appropriés. Incuber ensuite les cellules et les anticorps pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière après l'incubation.

Lavez les cellules deux fois avec la solution de perméabilisation. Après le dernier lavage, resuspendez les cellules dans du paraformaldéhyde à 1 % dans du DPBS pour fixer les cellules. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à leur utilisation, pendant un maximum de 24 heures.

Une fois les cellules marquées, utilisez un cytomètre de flux LSR deux ou un cytomètre de flux Cyan AD pour effectuer les analyses. Ensuite, analysez les données à l'aide de FlowJo ou d'un logiciel similaire. La composition des PBMC dans Maca reuss a été déterminée à l'aide d'une analyse par cytométrie en flux.

Cette figure montre le schéma de sélection utilisé pour l'analyse des différents sous-ensembles de lymphocytes T provenant d'un animal représentatif. Les lymphocytes ont d'abord été sélectionnés par diffusion directe FSC en fonction de la diffusion latérale SSC, puis les lymphocytes viables ont été identifiés selon la population négative pour SSC et AQUA. Les cellules T ont ensuite été identifiées par l'expression de CD trois ; les populations CD quatre positif, CD huit négatif, et CD quatre négatif CD huit positif au sein de la population de cellules T positives pour CD trois ont également été déterminées.

Les cellules T CD quatre positif et CD huit positif ont été davantage distinguées en différents sous-ensembles selon l'expression de CD 28 et de CD 95, en cellules naïves, à mémoire centrale et à mémoire effettrice. Cette figure montre la production d'interféron gamma et d'IL deux dans les cellules T CD quatre positif non stimulées et stimulées par le PMA/ionomycine, ainsi que dans leurs sous-ensembles.

Notez les profils de cytokines distincts induits par la stimulation. Dans chaque sous-ensemble. Nous devons vous montrer comment effectuer une analyse de cytométrie en flux multiparamétrique de pbmc.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer à la fois des contrôles de compensation monocolorés et des contrôles « fluorescence moins un ». Ces deux types de contrôles sont nécessaires pour une analyse correcte des données de cytométrie en flux. Veuillez consulter notre protocole écrit pour plus d'informations sur le choix des contrôles de compensation.

De plus, veuillez vous rappeler que lors de l'utilisation d'un anticorps marqué par un fluorochrome, il est important de couvrir les échantillons afin de les protéger de l'exposition à la lumière. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.