Christopher Hughes: un modèle in vitro pour l'étude de l'angiogenèse (Interview)

Bonjour, je m'appelle le Dr Christopher Hughes. Je suis professeur à l'Université de Californie à Irvine, et mon laboratoire étudie l'angiogenèse. Nous nous intéressons plus particulièrement aux gènes qui régulent ce processus d'angiogenèse.

Nous avons optimisé un test in vitro basé sur les travaux de Nelson et, dans ce test, nous pouvons observer tous les processus différents qui se déroulent pendant l'angiogenèse. Nous enroberons des billes Teflon, de petites billes, avec des cellules endothéliales. Ensuite, nous les incorporons dans des gels de fibrine. Nous ajoutons des facteurs de croissance.

Et au cours de plusieurs jours, les cellules endothéliales émergent des billes. Elles migrent, s'alignent, prolifèrent, forment des tubes, se ramifient et établissent des anastomoses. Ainsi, vers le dixième jour, nous obtenons en culture un réseau complet de type capillaire.

Eh bien, certains des problèmes liés aux tests *in vivo* et aux essais d'angiogenèse, par exemple ceux réalisés chez la souris, tiennent au fait qu'il est beaucoup plus difficile de manipuler le système. Il est difficile d'observer ce qui se passe à l'intérieur d'un animal ; on ne peut pas vraiment voir l'angiogenèse en cours. En revanche, si vous souhaitez manipuler le système dans nos cultures *in vitro*, il est très facile de modifier génétiquement les cellules endothéliales, d'activer ou d'inactiver des gènes, et d'examiner les effets de ces manipulations sur l'angiogenèse par bourgeonnement.

Et il est beaucoup plus difficile de faire cela chez l'animal entier. Vous devez créer des knockouts ou des knockins. Ce sont donc les deux principaux avantages.

Il est facile à manipuler et facile à visualiser. Au fil des années, un certain nombre de tests d’agenèse in vitro différents ont donc été mis au point, chacun présentant des avantages et des inconvénients. En particulier, l’un des plus connus est le test du gel matriciel, dans lequel des cellules endothéliales sont placées sur un matériau matriciel extracellulaire appelé Matrigel.

Et le problème est que les cellules endothéliales forment des structures en cordons, mais qu'elles ne forment jamais de véritables vaisseaux lumineux. On n'observe ni bourgeonnement ni anastomose. Il existe des modèles en gel de collagène, qui peuvent être intéressants.

Il existe de nombreux cas où l'on n'observe pas la prolifération des cellules endothéliales. On n'observe généralement pas d'anastomose. Le test du gel de fibrine que nous avons mis au point est basé sur un modèle élaboré par Nelson Kar et publié au milieu des années quatre-vingt-dix.

Et nous avons maintenant considérablement amélioré cela, au point de pouvoir observer toutes les étapes de l'angiogenèse. Nous pouvons suivre la formation initiale de bourgeons, la migration. Nous observons la prolifération des cellules, la formation de la lumière, l'apparition de ramifications, et enfin l'anastomose, permettant ainsi la constitution d'un réseau vasculaire complet in vitro.

Cet essai est, selon nous, le meilleur système in vitro disponible si vous souhaitez observer toutes les différentes étapes de l'angiogenèse. Un autre avantage de cet essai in vitro est que nous pouvons réaliser une capture laser par microdissection : nous pouvons centrifuger la culture pour la rendre très plate, puis utiliser le microscope de microdissection avec capture laser. Nous pouvons ainsi isoler des cellules individuelles, et plus particulièrement, nous intéresser aux cellules de bout (tip cells).

Nous les coupons donc et nous pouvons examiner l'expression génique, en particulier dans les cellules apicales par rapport aux cellules du tronc, les cellules qui forment effectivement la lumière. Notre hypothèse est qu'il existera une expression génique différentielle entre ces deux populations cellulaires. Nous pouvons analyser cela, ce qui serait pratiquement impossible à réaliser dans un système in vivo.

Nous pensons donc qu'il s'agit d'un autre avantage majeur de l'utilisation de ce test in vitro. Les premiers travaux réalisés dans ce domaine, comme je l'ai mentionné par Nelson Recon, utilisaient des cellules endothéliales microvasculaires. De nombreuses réflexions suggèrent que les cellules endothéliales microvasculaires sont les cellules que l'on souhaiterait utiliser pour un test de ce type, car in vivo, ce sont les cellules endothéliales microvasculaires qui forment réellement de nouveaux vaisseaux.

Nous avons décidé d'essayer de faire cela avec des ve. Il s'agit de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, et ce pour plusieurs raisons. L'une d'entre elles est que ces cellules sont très faciles à obtenir.

Vous pouvez vous rendre à l'hôpital, obtenir des cordons ombilicaux provenant des salles d'accouchement et isoler facilement les cellules. Ces cellules sont par ailleurs utilisées en culture depuis de nombreuses années. Elles sont très bien caractérisées.

Nous avons donc mis en place ce test et l'avons optimisé afin de pouvoir utiliser ces cellules pour ces raisons. Et de manière intéressante, il s'avère que les VEC, ces cellules endothéliales de gros vaisseaux, semblent adopter la forme de cellules endothéliales microvasculaires en culture. Elles perdent de nombreux gènes normalement exprimés par les cellules endothéliales des gros vaisseaux et commencent à exprimer des gènes normalement associés aux cellules endothéliales microvasculaires.

Et elles sont parfaitement capables de former des bourgeons de type capillaire, de créer des lumières et de produire ce qui ressemble en tout point à de véritables capillaires en culture. Elles sont donc faciles à utiliser, faciles à manipuler, et accomplissent ce que nous souhaitons. Elles émettent des bourgeons et forment des vaisseaux correctement luminalisés.

Lorsque nous souhaitons quantifier ce test, il existe en réalité plusieurs approches possibles. Nous pouvons examiner des critères véritablement quantitatifs, tels que le nombre de bourgeons, la longueur des bourgeons, le diamètre des bourgeons, le nombre de points de branchement, le nombre d'anastomoses, mais nous pouvons également évaluer des critères qualitatifs. Par exemple, observons-nous la formation de lumières ?

Et c'est probablement ce qui nous intéresse le plus. Dans beaucoup des tests que nous effectuons, il s'agit de la formation adéquate de la lumière. Il s'agit en réalité davantage d'une évaluation qualitative, bien que, lorsque les vaisseaux deviennent plus gros, on puisse également mesurer le diamètre de ces lumières.

Nous utilisons donc des fibroblastes dans ces cultures. Nous intégrons les billes dans le gel de fibrine et nous ensemenceons des fibroblastes au-dessus du gel. Les fibroblastes sont absolument essentiels à une émission de bourgeons et à la formation de lumière adéquates.

En l'absence de fibroblastes, on observe une certaine formation de bourgeons. Toutefois, les cellules endothéliales ont tendance à ne pas rester attachées les unes aux autres. Ce qui se produit, c'est qu'elles migrent séparément.

Ainsi, toute structure que vous développez sur cette pousse a tendance à se désagréger. Et après quelques jours, les cellules endothéliales subissent une apoptose. On dirait donc que les fibroblastes produisent des facteurs essentiels à l'angiogenèse, du moins dans ce système in vitro.

Nous nous sommes fortement intéressés à l'identification de ces facteurs. Ce que nous avons découvert, c'est que les fibroblastes sécrètent une substance dans le milieu, de sorte que nous pouvons prélever un milieu conditionné à partir des fibroblastes, lequel permet une émission correcte de bourgeons et la formation de lumière. Nous sommes donc clairement en présence d'un facteur soluble.

Il est donc évident que nous sommes très intéressés à savoir ce que produisent les fibroblastes et qui est si important pour l'angiogenèse dans ce système. Nous avons testé tous les facteurs habituels : le VEGF, le fg F de base sont présents en culture, mais leur ajout supplémentaire ne remplace pas les fibroblastes. Nous avons également essayé l'angiopoïétine 1, le TGF bêta, le H GF, etc., etc.

Jusqu'à présent, nous n'avons pas trouvé le facteur essentiel. Ce que nous faisons maintenant consiste donc à purifier des facteurs à partir du milieu conditionné de fibroblastes. Nous faisons donc passer le milieu conditionné sur diverses colonnes, échangeuses de cations, d'exclusion stérique, et nous obtenons des fractions possédant une activité.

Et nous suivons désormais cette activité, en prélevant ces fractions pour identifier celles qui sont actives. Ensuite, nous pouvons les analyser par électrophorèse sur gel, vérifier que nous obtenons seulement un nombre relativement faible de bandes sur le gel, puis exciser ces bandes et les faire séquencer par spectrométrie de masse. Cela nous réserve de très nombreuses journées passionnantes. Nous disposons désormais de plusieurs gènes candidats que nous testons individuellement afin de déterminer s’ils constituent effectivement le facteur que nous recherchons.

Nous avons donc testé de nombreux facteurs angiogéniques connus et nous savons que le VEGF et le FGF basique sont en réalité essentiels pour une bourgeonnement correct dans ce test. Mais ils ne racontent pas toute l'histoire. Il existe des facteurs dérivés qui sont importants, comme je l'ai mentionné, et une manière dont nous avons étudié cela consiste à utiliser des cellules tumorales, qui sont fortement angiogéniques in vivo, formant de grandes tumeurs chez la souris et fortement vascularisées.

Nous avons examiné ces cellules tumorales et elles expriment des niveaux très élevés de VEGF ; nous les avons ajoutées à nos cultures. Ainsi, nous avons remplacé les fibroblastes par ces cellules tumorales, et elles ne soutiennent pas une angiogenèse robuste dans ce test. Et cela, c'est très intéressant.

Ce que cela suggère, et cela a également été proposé par d'autres chercheurs, c'est qu'il existe une communication croisée entre la tumeur, le stroma S, qui correspond aux fibroblastes et aux autres cellules de soutien dans le tissu, et les cellules endothéliales. Il se peut fort bien que les cellules tumorales produisent certains facteurs agissant directement sur les cellules endothéliales, mais elles en produisent également d'autres qui stimulent les fibroblastes et d'autres cellules stromales à synthétiser des facteurs qui, à leur tour, favorisent une angiogenèse vigoureuse.