Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Ce protocole utilise un promoteur régulable qui permet une expression contrôlée des protéines. Dans cette expérience, nous utilisons un plasmide bicopie de deux microns qui exprime le domaine N deux à partir d'un promoteur répressible par la méthionine. Des cellules de levure de type sauvage sont transformées avec ce plasmide.

Les plasmides et les transformants sont sélectionnés sur des plaques dépourvues de uol. Après une croissance nocturne, les cellules en milieu de sélection sont synchronisées par un arrêt de croissance non médié par le cortisol.

Enfin, l'expression est induite en transférant les cellules dans un milieu dépourvu de méthionine pendant l'expérience cinétique. La concentration en protéines est surveillée par immunoblotting et le développement du phénotype morphologique par microscopie. Bonjour, je suis Claudia du Département des sciences biologiques de l'Université Purdue.

Je suis de Bari Muji dans l'alar et je suis également dans le laboratoire AL. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration protéique dans le corps induct. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les aspects morphologiques et moléculaires d'un phénotype de division cellulaire observé lors de la surexpression du domaine N deux de la protéine adaptatrice endocytaire absente deux.

Commençons donc. Ce protocole débute par la construction d'une souche de levure qui exprimera votre protéine d'intérêt. Dans notre cas, nous avons transformé la souche sauvage de levure W 3 0 3 avec un ADN plasmidique à haut nombre de copies contenant nth deux sous le contrôle du promoteur répressible par la méthionine ; deux millimolaire de méthionine supprime l'activité du promoteur met 25.

Bien qu'un milieu dépourvu de méthionine permette une expression maximale, sélectionnez six colonies à partir d'une plaque contenant des cellules récemment transformées et inoculez-les dans 50 millilitres de milieu sélectif contenant 0,2 millimolaire de méthionine dans un flacon conique ; incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation à 200 tr/min. Le lendemain matin, estimez la densité cellulaire en mesurant la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Transférez l'équivalent de 20 unités d'OD à 600 nanomètres par millilitre de cellules dans un tube stérile de centrifugeuse et récoltez par centrifugation.

Ré-suspendre les cellules dans du milieu YPD par vortexage afin de synchroniser le cycle cellulaire à une concentration finale de 15 microgrammes par millilitre à partir d'un stock de un milligramme par millilitre dans le DMSO. Incuber pendant quatre heures à 30 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min. Après quatre heures, vérifier le pourcentage de cellules arrêtées en mitose.

En observant au microscope et en comptant le nombre de cellules présentant des bourgeons de taille égale, passez à l'étape suivante. Ne procédez à la récolte des cellules par centrifugation à 2200 tr/min pendant cinq minutes que si l'arrêt dépasse 90 %. Après trois lavages avec de l'eau glacée, resuspendez le culot dans un milieu sélectif dépourvu de méthionine à une densité cellulaire d'environ 0,5 OD à 600 nanomètres par millilitre.

Transférez la moitié du volume de cellules dans un nouveau tube stérile et ajoutez de la méthionine à une concentration finale de 0,2 millimolaire. Ceci servira de témoin pour les effets dus aux niveaux basaux d'expression protéique. Replacez les deux cultures dans l'incubateur à 30 degrés Celsius.

Les cellules sont analysées pour l'acquisition de leur phénotype chaque heure, pendant six heures à chaque moment. Prélevez un millilitre de suspension cellulaire de chaque culture et transférez-le dans un tube microfuge stérile, puis récoltez les cellules par centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans 70 microlitres de milieu. Ajoutez ensuite 30 microlitres de bleu de méthylène provenant d'une solution mère à un milligramme par millilitre dans de l'eau stérile.

Ensuite, pipetez environ six microlitres de cette suspension sur une lame en verre propre et placez une lamelle au-dessus de la goutte. Appuyez doucement sur la lamelle afin de former une couche mince et uniforme de cellules entre les interfaces en verre. Divisez la lamelle en neuf quadrants et prenez trois images par quadrant.

Le nombre de cellules par champ ne devrait pas dépasser 30 cellules afin de permettre une quantification précise. Comptez le nombre de cellules présentant le phénotype étudié, qui, dans cet exemple, sont des cellules de levure bourgeonnantes avec des bourgeons allongés et/ou concaténés qui ne parviennent pas à se séparer les uns des autres. Nous comptons également le nombre de cellules mortes identifiées par leur couleur bleue, puisque le défaut de division cellulaire est induit suite à nth.

Une surexpression conduit à la mort cellulaire afin de visualiser les défauts phénotypiques spécifiques à chaque moment. Prélevez un aliquot de un millilitre de culture dans un tube microfuge stérile et récoltez les cellules par centrifugation. Suspendez le culot cellulaire dans 100 microlitres d'une solution Calcofluor blanc à un milligramme par millilitre dans de l'eau stérile et incubez pendant cinq minutes à température ambiante à l'abri de la lumière.

La coloration au blanc de calcior permet la visualisation de la paroi cellulaire. Lavez le culot trois fois avec un X PBS. Nous suspendons le culot final dans 100 microlitres de PBS.

Observer les cellules au microscope et acquérir des images à un grossissement de 100 x en utilisant des optiques UV pour visualiser la paroi cellulaire. Pour visualiser la septine marquée par GFP, acquérir des images en utilisant un filtre FS E. Quantifier le pourcentage de cellules présentant des défauts de paroi cellulaire et une mauvaise localisation de la septine à l’aide de la méthode décrite précédemment, en divisant la lame en neuf quadrants et en prenant trois images par quadrant pour le comptage de la vidéo en microcinématographie. La microscopie de cellules de levure individuelles nécessite des lits d’agarose intégrés dans le milieu de culture pour former un lit d’agarose.

Nettoyez d'abord une lame en verre présentant une dépression concave avec de l'alcool à 70 % et laissez-la sécher à l'air pendant que la lame sèche. Faites bouillir 0,06 gramme d'agros dans cinq millilitres de milieu sélectif dépourvu de méthionine au micro-ondes jusqu'à ce que l'agros soit complètement dissous rapidement. Pipetez 200 microlitres du milieu contenant l'agros sur la lame.

Appuyez et retournez une autre lame en verre propre au-dessus, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne soit piégée en dessous. Lorsque le gel est solidifié, éloignez délicatement la lame supérieure de la lame creuse en maintenant leurs surfaces parallèles en tout temps. Cela garantit que la surface du lit d'agarose soit bien plane avec la surface de la lame creuse.

Nettoyez la zone de la lame entourant le lit d'agros avec un tissu délicat. La lame est désormais prête à être utilisée au moment où le temps est égal à quatre heures. Transférez un millilitre de cellules depuis la culture vers un tube microfuge stérile et récoltez par centrifugation.

Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 100 microlitres de milieu sélectif frais dépourvu de méthionine. Appliquez de la vaseline sur les bords du lamelle. Ensuite, déposez une goutte de suspension cellulaire au centre du lit d'agarose et étalez-la uniformément en appuyant doucement un lamelle par-dessus.

Scellez les bords de la lame et fixez sa position en appliquant du vernis à ongles sur les bords. Une fois le vernis à ongles sec, placez la lame sur le plateau chauffant d’un microscope. Nous utilisons un microscope Zeiss Axio 200 M équipé d’une caméra numérique monochrome Zeiss Axio camm, MRM, pour choisir un champ contenant au maximum 10 cellules convenablement espacées, car le champ deviendra de plus en plus encombré au fil du temps.

À mesure que les cellules se divisent, prendre une image du champ toutes les cinq minutes pendant environ cinq heures. Afin d'éviter de devoir régler à nouveau la mise au point à plusieurs reprises, nous programmons le logiciel d'acquisition d'images pour acquérir automatiquement quelques images Zack à chaque point temporel.

L'image présentant la meilleure mise au point sera sélectionnée ultérieurement pour assembler le film, afin de garantir une chaleur adéquate pour les cellules. Une source de chaleur externe, en complément des plateaux chauffants, peut être assurée en laissant la lumière blanche transmise du microscope allumée pendant toute la durée de l'acquisition. La régression du phénotype peut être étudiée en assemblant les images en un film à l'aide du logiciel Image J. Ici, nous présentons des résultats représentatifs d'une surexpression de notre protéine d'intérêt. Nth deux.

Tout d'abord, l'expression protéique de la protéine nth deux. Au cours du suivi temporel de l'expérience, des lysats provenant de cellules exprimant la protéine HA nth deux ont été analysés par immunotransfert (western blotting) à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HA. Comme le montre le immunoblot, les cellules cultivées en présence de 0,2 millimolaire de méthionine présentent une expression protéique minimale. En revanche, les cellules cultivées dans un milieu dépourvu de méthionine montrent une augmentation constante de la concentration de S deux au cours du suivi temporel de l'expérience.

Ensuite, les cellules cultivées en présence ou en absence de méthionine pendant six heures ont été analysées, car une faible concentration de nth two ne permet pas d'induire un phénotype de division cellulaire ou une mort cellulaire uniquement. Un faible pourcentage de cellules sont mortes, comme l'indique leur couleur bleue après coloration au bleu de méthylène. De même, le nombre de noyaux par cellule, l'organisation de la paroi cellulaire et des septines sont normaux, comme attendu.

En revanche, la surexpression de M deux entraîne un défaut majeur de division cellulaire et une mort cellulaire, comme le montrent de longues chaînes de bourgeons allongés connectés qui conservent la couleur bleue lorsqu'ils sont colorés au bleu de méthylène. La majorité des cellules phénotypiques sont multinucléées, comme indiqué par la coloration au DPI. La coloration au blanc de calcio révèle l'accumulation de plaques anormales de paroi cellulaire.

En outre, la septine est fortement mal localisée et désorganisée. La quantification du phénotype en fonction du temps est présentée sur ce graphique, où les cercles ouverts représentent zéro millimolaire de méthionine et les cercles fermés représentent 0,2 millimolaire de méthionine. On observe ici que, lorsque la concentration de nth deux augmente dans les cellules au fil du temps, le pourcentage de cellules présentant le phénotype de division cellulaire augmente également.

Les cellules témoins cultivées à 0,2 mM de méthionine montrent que le développement du phénotype dépend d'une concentration élevée de protéines et non des conditions de culture cellulaire. Enfin, le développement du phénotype lors de la surexpression de Nth2 est observé par microscopie vidéo en temps réel.

Après quatre heures de culture, deux cellules surexprimant le gène montrent un phénotype modéré de division cellulaire au niveau de la morphologie. Au fur et à mesure que le film progresse, on observe des périodes anormales et prolongées de croissance du bourgeon apical, conduisant à des bourgeons très allongés. On observe également des apparitions de nouveaux bourgeons avant qu’un événement de séparation cellulaire n’ait lieu.

En outre, on observe que des bourgeons émergent de plusieurs régions de la cellule mère, donnant naissance à un aspect ramifié. Nous venons de vous montrer comment caractériser et analyser le développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration en protéine dans la liste des bourgeons. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les cellules aux vitesses de centrifugation recommandées, car des vitesses plus élevées pourraient endommager les cellules.

Il est également important de se rappeler d'ajouter le bleu de méthylène et le chlorure juste avant l'acquisition d'images, car ils sont toxiques pour les cellules light east. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.