Microdissection laser appliquée au profil d'expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Ici, nous fournissons une description détaillée de la microdissection laser appliquée à l'analyse comparative des profils de transcrits ARN de régions silencieuses et non silencieuses du disque wing de drosophile. Cette approche nécessite, comme matériel biologique, des disques imaginaux de drosophile disséqués manuellement, et comme équipement principal, un microdissécteur laser. Nous utilisons le LI A-L-L-M-D 6,000 et une machine PCR en temps réel.

Nous avons utilisé un BioRad iq. Les cinq petits outils nécessaires sont une plaque concave, un pinceau, des pinces de microdissection, une lame pour goutte pendante, des aiguillons d'insectes montés sur des aiguilles de seringue, un cadre métallique avec une membrane en PET et de petits tubes en plastique. Cette méthode comprend les étapes suivantes.

Étape une : croiser deux lignées transgéniques oph appropriées afin d'induire un silençage génique localisé et spécifique chez la descendance, en utilisant le système GAL4-UAS. Étape deux : traiter les cadres de dissection. Étape trois : mettre en place le microdissecteur laser.

Étape quatre, collecter manuellement les disques imaginaux des ailes parmi la descendance larvaire du croisement génétique. Étape cinq, effectuer une microdissection au laser de zones spécifiques des disques imaginaux marqués par la GFP. Étape six, le profilage de la transcription dans des régions équivalentes des zones silencieuses et non silencieuses du disque permettra d'établir les effets induits par l'extinction du gène d'intérêt.

Le profilage de la transcription in vivo du gène X nécessitera l'extraction d'ARN à partir des zones microdissectées, le contrôle de la précision de la dissection manuelle, l'évaluation de l'expression de la GFP dans les deux échantillons par RT-PCR, la quantification de l'expression des cibles putatives du gène silencieux dans les deux échantillons par RT-PCR en temps réel ou par analyse sur puces à ADN. Voici maintenant plus de détails sur chaque étape.

Première étape, le croisement génétique. Le croisement génétique implique des souches transgéniques GAL4-UAS et vise à obtenir des disques imaginaux silencieux chez la descendance larvaire. Le système GAL4 polyvalent permet d'activer un isolement génique spécifique et localisé par interférence ARN.

Une souche introduit dans le croisement le transgène conducteur qui exprime GAL4 selon un motif temporel ou spatial spécifique, ainsi qu'un rapporteur A-U-A-S-G-F-P permettant la visualisation du domaine d'expression de GAL4. La seconde souche introduit un transgène répondeur UAS qui exprime un ARN d'interférence en épingle à cheveu, capable de cibler spécifiquement le gène X une fois exprimé dans la cellule.

Cet ARN est clivé pour générer des ARN interférents courts, capables de silencer spécifiquement le gène X sélectionné chez la descendance de ce croisement. Le transgène d'interférence sous contrôle de l'UAS n'est transcrit que dans les cellules exprimant la protéine GAL4, induisant ainsi un silençage spatialement restreint du gène X. Parmi la variété d'applications possibles, nous nous sommes concentrés sur le profilage des transcrits d'ARN dans le disque wing soumis à un silençage par le conducteur GAL4 Grailed, qui dirige un silençage spécifique dans le compartiment postérieur.

La région de silence est marquée par l'expression du transgène U-A-S-G-F-P dans le compartiment postérieur. Deux événements seront déclenchés : l'expression de GGFP et le silence du gène x.

Deuxième étape, traitement des cadres de dissection pour inhiber l'activité des ARN. Laver les lames porte-cadres et les outils de dissection avec de l'eau DEPC pendant au moins une heure à température ambiante, puis les laisser sécher dans une enceinte stérile. Pour inhiber l'activité des ARN, utiliser un tube neuf de 50 ml déjà exempt d'ARN, rempli d'eau DEPC, dans lequel on place une pince, une lame avec goutte suspendue et un cadre à culture.

Les deux sont nécessaires pour la microdissection. Fermez le tube, retournez-le, puis laissez réagir pendant au moins une heure. À température ambiante, une heure plus tard, transférez l'eau DEPC dans un autre tube à l'aide de la pince.

Retenez les lames à l'intérieur du tube afin qu'elles ne tombent pas. Ensuite, laissez les lames sécher à l'intérieur du tube. Étape trois, installation pour la microdissection.

Tout d'abord, allumez tous les appareils nécessaires : la lampe à fluorescence, le microscope et le logiciel de microdissection. Une fenêtre d'avertissement vous rappellera d'allumer également le laser. Faites-le et laissez le laser chauffer pendant que vous terminez la mise en place de la microdissection.

Il est maintenant temps de préparer les puits dans lesquels collecter les tissus. Couper. L'appareil de découpe laser Leica LMD 6 000 permet le chargement de jusqu'à quatre tubes pour collecter différents échantillons. Pour notre objectif, nous avons besoin uniquement de deux tubes.

Un pour collecter le tissu silencieux GFP positif, l'autre pour collecter le tissu GFP négatif avec un micro pince. Remplissez les deux bouchons de tube avec 20 microlitres de solution de réactif tri pour préserver l'ARN. Désormais, la microdissection est prête à être utilisée. Étape quatre, dissection manuelle des disques d'imagerie des ailes provenant de larves joof.

Isolez les disques wing à partir de la descendance larvaire obtenue comme décrit précédemment, et veillez à ce que d'autres tissus n'entachent pas les disques. Pour atteindre cet objectif, l'approche de dissection est très différente de celle couramment utilisée pour collecter l'ensemble des disques d'origine. Tout d'abord, lavez la larve dans une solution de Ringer afin d'éliminer le milieu adhérent. Ensuite, transférez-la sur une goutte pendante et sectionez la tête en tirant immédiatement sur la bouche vers le bas.

À l'aide des épingles à insectes, disséquez maintenant soigneusement les autres tissus. Le contour rouge indique les disques imaginaux des ailes à prélever. Conservez les disques exempts des tissus adhérents rapidement et délicatement. Transférez chaque disque d'aile isolé vers un cadre de dissection pour une coupe immédiate.

Cette procédure doit être répétée jusqu'à ce qu'un total de cent disques thoraciques soit atteint. Étape cinq : microdissection au laser de zones spécifiques des disques thoraciques marqués par la GFP. Une fois le disque thoracique d'origine placé sur la membrane, vous pouvez procéder à la découpe.

Placez le cadre sur son support et fixez le support sur la platine motorisée. Recherchez le disque de l’aile d’origine à l’aide du LMD 6 000 utilisé comme microscope ordinaire. Mettez-le au point et définissez la coupe.

Dessinez une zone ovale qui s'ajustera des deux côtés du disque, celle positive pour la GFP et l'autre. Sélectionnez le bouchon de tube où vous souhaitez recueillir la partie positive pour la GFP. Appuyez sur le bouton Démarrer la coupe.

Le microdissecteur procède à la coupe du tissu à la vitesse et à la puissance que vous avez définies précédemment en sélectionnant la fonction de déplacement et de coupe. Vous pouvez affiner manuellement la coupe jusqu'à ce que le fragment de tissu non sélectionné tombe. L'animation 3D montre ce qui se passe sous le microdissecteur : un laser est focalisé sur le tissu, réalisant une coupe le long du périmètre sélectionné.

Une fois la coupe effectuée, le fragment de tissu tombe dans le bouchon de tube sélectionné, puis consécutivement dans le Tri Réactif. Après la première coupe, déplacez la zone de découpe de l'autre côté du disque wing pour prélever une région équivalente négative pour la GFP. Avant d'effectuer une nouvelle coupe, assurez-vous de sélectionner un bouchon de tube différent afin de maintenir séparés les tissus positifs pour la GFP des tissus négatifs.

Appuyez sur le bouton de démarrage de la coupe après la coupe automatique. Passez ensuite à l'affinage manuel de la coupe, tel qu'indiqué par l'animation 3D, avant la deuxième coupe. La platine motorisée déplace le bouchon du tube sélectionné sous la zone de coupe.

Le faisceau laser se concentre sur le tissu coupé le long du périmètre sélectionné, et une fois la coupe terminée, le fragment de tissu tombe dans le bouchon de tube sélectionné contenant le réactif Tri. Pour recueillir suffisamment de matériau, nous avons répété la procédure sur une centaine de disques imaginaux des ailes. Une fois les échantillons collectés, retirez les tubes.

Il s'agit d'une étape délicate qui peut vous faire perdre tout le travail effectué jusqu'à présent. Soyez donc prudent. Fermez le bouchon à l'envers et poursuivez l'expérience.

Ceci est celui avec le tissu positif pour la GFP. Ceci est l'autre avec le tissu négatif pour la GFP. Étape six, profilage de la transcription.

Faites tourner les tubes pour détacher le liquide du bouchon et ajoutez le réactif Try jusqu'à un millilitre. Effectuez l'extraction d'ARN en suivant le protocole standard du réactif Try à partir de cent zones d'environ 5 000 micromètres carrés chacune. Notre rendement était de 1,5 microgramme d'ARN.

Nous utilisons un trois en exposant dans du vitrogène pour synthétiser l'ADNc avec un hexa aléatoire. La précision de la dissection manuelle a été contrôlée en vérifiant l'expression de la GFP dans les deux échantillons par RT-PCR. Comme indiqué sur le gel avec une RT-PCR quantitative.

Nous avons évalué les niveaux d'expression du gène silencieux X ainsi que ceux des cibles putatives possibles de la voie régulatoire médiée par le gène X. Ce diagramme montre un exemple des niveaux d'expression du gène X et de l'une de ses cibles putatives. Appelons-les gènes Y par rapport à leurs niveaux d'expression basaux dans les compartiments antérieur et postérieur des disques d'ailes non solidifiés.

L'activité du gène X sélectionné s'est révélée réduite à 40 % après inhibition. En revanche, l'un de ses gènes cibles putatifs, le gène Y, a montré une surexpression significative, avec une augmentation de sept fois, ce qui nous a conduit à valider l'hypothèse selon laquelle il est régulé négativement par le gène X. Nous concluons que l'approche expérimentale décrite ci-dessus peut être appliquée avec succès à la validation de cibles putatives dans diverses voies régulatrices.